大鼠脑组织冰冻切片免疫组化漂片法的实验研究

邵敏峰 章正祥⋆ 陈 强 邓 玉 程 静 侯 群

·论著·

大鼠脑组织冰冻切片免疫组化漂片法的实验研究

邵敏峰 章正祥⋆ 陈 强 邓 玉 程 静 侯 群

目的 探讨大鼠脑组织冰冻切片免疫组化可行的技术方案，并分析其实验结果。方法 以大鼠下丘脑A11区酪氨酸羟化酶TH为例，应用漂片法进行免疫染色。结果 组织切片完整，染色背景干净，未见非特异染色，TH阳性表达明显，形态正常。结论 应用漂片法对大鼠脑组织进行免疫组化染色，可优化染色效果，提高工作效率。

漂片法 免疫组化 冰冻切片

免疫组织化学（IHC）是常规病理诊断中不可缺少的重要方法，在神经科研中也至关重要。常规免疫组化采用贴片法进行染色，操作步骤中易发生干片，试剂使用量较大，染色组织数量较少，对需要进行大样本量免疫组化染色，此法较为困难。作者应用漂片法对大鼠脑组织冰冻切片进行免疫组化染色，过程中不易干片，试剂使用节约，一次可染色较多数量组织，可大幅提高工作效率，且取得理想的实验效果。2016年5月至6月作者以大鼠下丘脑A11区域酪氨酸羟化酶TH为例，利用冰冻切片免疫组化漂片法进行染色的应用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠，体重250～300g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号码SCXK（沪）：2013-0016。浙江中医药大学动物实验中心饲养。

1.2 仪器及主要试剂 内源性过氧化物酶阻断剂（中杉金桥）；Triton X-100（美国sigma公司）；PBS磷酸缓冲液（石家庄天舜生物）；小鼠酪氨酸羟化酶单克隆抗体（美国sigma公司）；山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物（中杉金桥）；浓缩型DAB试剂盒（中杉金桥）；恒温冷冻切片机（Thermo Scientific，microm HM 550）；OLYMPUS IX71倒置显微镜（日本OLYMPUS）

1.3 方法 （1）取材及固定：大鼠用1%戊巴比妥钠（5ml/kg）麻醉后，开腹夹闭腹主动脉，开胸用灌流针行左心室穿刺，至升主动脉，剪开右心耳，先快速灌注生理盐水200～300ml，至右心耳流出澄清液体，然后灌注4%多聚甲醛磷酸缓冲液200～300ml，先快后慢灌注，至上肢、颈部僵直，即固定完成，灌注后取大鼠脑组织。4℃条件下将脑组织在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中再固定24h。（2）脱水及冰冻切片：将脑组织转移至30%蔗糖-PBS液中脱水72h。擦干表面液体，铝箔纸包裹，于液氮中速冻10s左右，存于-80℃冰箱。根据《大鼠脑立体定位图谱》（第6版）对下丘脑A11区进行定位。冰冻切片机连续切片，厚度为30μm，取10张脑片存于盛有PBS液的6孔板中。（3）免疫组化漂片法染色：①脑片收集于0.01M的PBS液后，置于摇床中10min洗去OCT。②将脑片转移至盛有PBS液的12孔板中并吸干液体，加入3%H2O2400μl室温孵育15min，除去内源性过氧化物酶。③PBS液漂洗5min，共3次。④吸干PBS液，加入含有0.3%Triton X-100的PBST液400μl，室温孵育30min。⑤吸干液体，加入TH小鼠抗大鼠单抗（稀释度为1：2000）400μl，置于4°冰箱孵育过夜，共计17h。⑥PBS液漂洗10min，共3次。⑦吸干PBS液，加入辣根酶标记抗鼠IgG 聚合物7滴，37°孵育20min。⑧PBS液漂洗10min，共3次。⑨DAB避光显色5～10min，待肉眼观察到脑片显色出适当程度，及时终止显色。⑩PBS液漂洗5min，共3次。贴片，置于37°鼓风箱10min，烘干组织表面液体。85%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇梯度脱水各2min。二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各透明2min，中性树胶封片。

2 结果

显微镜下观察（4×10倍和10×10倍），组织切片完整，染色背景干净，染色均匀，未见非特异性染色，TH阳性表达明显，胞浆呈棕黄色，形态呈三角形或多极状，有较长的突起。见图1～3。

图1 下丘脑A11区酪氨酸羟化酶TH（4×10）

图2 下丘脑A11区酪氨酸羟化酶TH（左侧，10×10）

图3 下丘脑A11区酪氨酸羟化酶TH（右侧，10×10）

3 讨论

免疫组化技术在实验中经常使用，在神经科研中尤其重要。免疫组化染色要根据需要证明的抗原种类，标本中的抗原保存情况，实验的精度要求和实验室的条件来选择最佳的方法，选择原则包括：特异性、敏感性、简便性、安全性、省时省钱［1］。石蜡切片染色处理步骤多，石蜡对组织抗原有破坏作用，相比之下，冰冻切片具有保护抗原不受破坏，简便的优势。贴片法是将冰冻切片后的组织贴于涂有多聚赖氨酸的防脱载玻片上，进行染色的方法。在实际操作过程中，贴片法存在以下缺点：（1）组织容易变干导致蛋白变性，抗原性丧失，表现为不着色或一片棕色，从而干扰实验结果［2］。（2）染色中试剂消耗量较大。（3）每一张载玻片上可贴组织数量较少，如大批量染色比较困难。（4）贴片法在操作过程中易发生脱片。在国外，脑组织冰冻切片漂片法得到广泛应用，Majercikova Z等［3］利用漂片法对下丘脑fos蛋白进行免疫组化染色，取得理想的结果。

作者针对以上缺点，利用冰冻切片漂片法进行免疫组化染色，因脑片在整个染色过程中未脱离液体，不会发生干燥而产生假阳性。12孔板中各孔可同时放入多张脑片进行染色，可大幅提高免疫组化染色效率。染色过程中，加入试剂只需浸没脑片即可，可节省试剂用量。因此，对于需要大批量免疫组化染色，可利用漂片法达到理想的结果。

在操作过程中，作者认为：（1）脑组织冰冻切片前应在-20℃切片机中平衡30min。（2）若用漂片法进行染色，组织切片厚度不应太薄，一般在20～40μm。（3）切片后脑片需要漂洗以洗去溶于PBS液中的OCT。（4）对于是否需要抗原修复有不同看法，一般认为冰冻切片可不需要抗原修复，因冰冻切片较石蜡切片对抗原的破坏程度要小。（5）漂洗应充分，以减少非特异性染色的干扰。（6）漂洗过程中需要转移脑片，作者采用带有100μm网孔底的细胞过滤筛，置于6孔板中，这样可以使在两个6孔板间转移脑片更为便捷［4］。（7）DAB显色时间不宜过长，一般＜10min，因阳性物质超过一定时间不会随时间延长而继续增加［5］。（8）贴片时可以将脑片转移至盛满PBS液的小盒中，将防脱载玻片的一端浸入PBS液中，呈30°～45°，液面浸至预贴位置为止，用柔软的毛刷将脑片展开，推动至液面，并尽可能靠近载玻片，脑片的一侧附着在玻片后，将玻片顺势移出液体，脑片可平整贴于载玻片上。（9）采用一步法聚合物检测系统进行免疫组化染色，将二抗抗体分子与酶聚合在一起，直接放大抗原抗体结合的信号，不涉及生物素，可减少操作过程。

综上所述，应用漂片法对大鼠脑组织进行免疫组化染色，可优化染色效果，提高工作效率，尤其适用于大批量进行脑片的免疫染色，其中的应用条件还需要各个实验室的不断探索。

［1］ 孟庆媛, 刘东璞, 郭梦凡, 等. 免疫组织化学染色技术实际应用体会. 黑龙江医药科学, 2006, 1:82-83.

［2］ 宋容. 免疫组织化学染色技术的应用体会. 重庆医学, 2007, 22: 2331-2332.

［3］ Majercikova Z, van Weering H, Scsukova S, et al. A new approach of light microscopic immunohistochemical triple-staining: combination of Fos labeling with diaminobenzidine-nickel and neuropeptides labeled with Alexa488 and Alexa555 fluorescent dyes. Endocrine Regulations, 2012(46): 217-223.

［4］ Bachman J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods Enzymol, 2013, 533: 207-15.

［5］ 巴迎春, 王廷华, 李明. 用免疫组化ABC法的漂片法做好脑片实验的体会. 四川解剖学杂志, 2006, 1: 58-59.

Objective To introduce a feasible technical scheme of rat's frozen brain section for immunohistochemical staining，and to evulate the outcome. Methods Rat's tyrosine hydroxylase（TH）in hypothalamus A11 area was taken as example，used floating-frozen section immunostaining. Results Tissue section was complete，dyeing background was clean，without nonspecif i c staining，TH positive expression with normal form was obvious. Conclusion Using free fl oating staining of rat's brain tissue is benef i cial to optimize staining quality and improve the work eff i ciency.

Bleaching method IHC Frozen section

国家自然科学基金资助项目（81302938）；浙江省中医药优秀青年人才基金计划（2013ZQ015）；2011年度浙江中医药大学科研基金人才专项项目；2017年浙江省医药卫生科研基金项目（2017KY118，2017KY509），2017年度浙江省中医药科学研究基金项目（2017ZA047）

310053 浙江中医药大学第一临床医学院（邵敏峰 邓玉 程静）310006 浙江中医药大学附属第一医院（章正祥 陈强侯群）

*通信作者