微生物功能基因组学的研究方法综述

朱江平

摘 要：功能基因组学在结构基因组所提供的高通量的信息资源以及丰富的生成产物基础上，通过在基因组水平或系统水平上全面分析基因的功能，针对多个基因或蛋白质组成系统的进行研究，来得到基因的表达、调控与功能以及生物的生长、发育的相关规律。本文介绍了功能基因组学的各种研究方法，并分析其发展状况。

关键词：功能基因组；高通量数据；生物信息学

中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）10-0190-01

功能基因组学（后基因组学），是在结构基因组所提供的丰富的高通量信息资源以及大量各类生成产物的基础上发展起来的基因组学的子学科。其通过在功能基因组水平或功能系统水平上全面地分析基因的功能，发展和提出了多种实验手段和分析方法，使得生物学的研究对象由单一基因或蛋白质转为多个基因或蛋白质组成的系统，进而得到关于基因表达、调控、功能以及生物的生长、发育的相关规律。

1 差异显示反转录PCR技术

差异显示反转录PCR（DDRT—PCR）技术是由Liang和Pardee等提出的，以PCR和聚丙烯酞胺凝胶电泳为基础的功能基因组学的传统方法。该方法的基本原理是：以1对细胞（或组织） 的總RNA反转录而成的cDNA为模板，利用PCR的高效扩增，通过5端和3端引物的合理设计和组合，将细胞（或组织） 中表达的基因片段直接显示在DNA测序胶上，从而找出1对细胞（或组织）中表达有差异的cDNA片断。DDRT—PCR具有周期短，功能多，灵敏度高，所需RNA的量较少并且重复性较高等优点。但是，在实际施行过程中， DDRT—PCR技术存在着假阳性率高、凝胶中单条cDNA带成分不均一、所获cDNA仅代表mRNA 3UTR（非翻译区）、一些低拷贝数mRNA不能有效呈现等问题。[1]

2 基因表达序列分析

基因表达序列分析（SAGE）是Velculescu等人建立的一种快速高效地分析转录物的实验方法。其理论依据是：基因组中95%的基因可以由来自cDNA 3端特定位置的一段9—11bp长的序列加以区分。这一段特异的基因序列被记作SAGE标签。基因表达序列分析通过对cDNA制备SAGE标签，然后将这些标签串联起来并对其进行测定，可以显示出各SAGE标签所代表的基因在特定的组织中是否有表达，同时还可以将SAGE标签所出现的频率作为其所代表的基因表达程度的指标。但是，应用SAGE技术有一个重要前提条件：GenBank中必须有某一物种足够多的DNA序列的资料（特别是EST序列的资料）。[2]

3 微阵列分析

DNA微阵列（microarray assay）技术包括cDNA微阵列和DNA芯片（DNA chip）两种方法，这两种方法的原理相同。首先是在固相表面合成成千上万个寡核苷酸“探针”（cDNA、EST或基因特异的寡核苷酸），该过程会用到光导化学合成、照相平版印刷和固相表面化学合成等技术。接着将寡核苷酸“探针”与来自不同细胞、组织或整个器官的用放射性同位素或荧光物标记的DNA或mRNA反转录生成的第一链cDNA进行杂交。最后对每个杂交点进行定量分析。定量分析的结果可以用于DNA测序、DNA突变和多态性分析以及对同一组织细胞在不同状态下或在同一状态下多种组织细胞基因表达水平的差异的检测，还可以发现新的致病基因或疾病相关基因等。微阵列分析的优点是可以同时对大量的基因，甚至是整个基因组的基因表达进行对比分析，并且在核苷酸杂交技术的各个方面应用。其在同时比较同一组织在不同状态下或各组织之间DNA序列分析以及基因的表达状况等方面具有极大的优越性。

4 反义RNA分析

反义RNA是能与靶RNA互补配对的，用来定点分析某一段DNA片段（基因）功能的小分子RNA。反义RNA分析即是利用反义RNA来进行功能基因组分析的方法。该方法首先分离基因片段的mRNA，合成其mRNA的互补RNA（反RNA）。然后给反RNA加上基因表达必需的元件（如启动子等），接着插入T-DNA。将其转化到植株中，那么合成的基因就会在植株中表达，并表现出相应性状。因为反义RNA与靶RNA碱基配对的结合方式，反义RNA可以在DNA复制、转录和翻译水平上对基因表达加以调控。

5 蛋白质组分析

蛋白质组分析方法主要涉及两个步骤：蛋白质的分离和蛋白质的鉴定。用于蛋白质分离的技术主要是双向凝胶电泳（2-dimensional gel electrophoresis，2-DE），其原理是细胞抽提物在电泳过程中蛋白质个体首先依据所带电荷然后依据分子大小被分离。这种方法的最大缺点是重复性差，使得几乎不能同来自其他实验室的资料进行比较。

6 生物信息学

生物信息学将DNA和蛋白质作为研究对象，以计算机等计算工具为基础，发展更新各种软件，收集、整理和储存DNA和蛋白质的序列和结构数据，并加以分析进而发现藏在基因序列中的规律。应用生物信息学可以对功能基因组研究过程中产生的高通量，高维度的数据进行处理，应用数理统计的方法，以计算机的快速运算能力，找到功能基因组的相关信息。常应用生物信息学将未知DNA序列与数据库中收集的DNA序列进行同源性比较，或应用相关软件进行核苷酸及氨基酸序列的同源性比较，以此来获得未知DNA序列的功能信息。[3]

7 小结与展望

随着发展，基因组学由结构基因组学向功能基因组学发展，由此也产生了大量应用于功能基因组研究的工具和方法。这些方法从不同的角度和方向挖掘基因本身蕴含的丰富信息资源。功能基因组学无论是应用于获取大量基因功能信息，亦或是针对特定基因的研究都取得了突破性的进展，发展速度迅速。但随着各类研究的不断深入进行，这些方法的精确性和准确性会渐渐不再满足条件，同时各项技术尚未解决的一些问题也会被放大，单个方法或技术可能难以对新的问题有较好的应用。结合各种方法，扬长避短，综合应用各种技术可以对功能基因组有更全面、深入的研究。[4]

功能基因组学的应用十分广泛，从动物、植物到微生物群落分析都可以取得较好的研究成果，也可以应用于医药、毒理等领域。随着计算机技术的发展，将生物信息学应用于功能基因组学，借助计算机强大的计算能力，功能基因组学将能取得更大的突破。

参考文献

[1]赵锦荣，阎小君，苏成芝.差异显示反转录PCR 技术研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2000，27（1）：28-32.

[2]常青山，余增亮.基因表达分析方法及其研究进展[J].生物技术通报，2002，（6）：27-31.

[3]沈春修.生物信息学在基因组学中的应用[J].安徽农业科学，2007，35（20）： 6054-6055，6057.

[4]赵先萍.功能基因组学的研究方法及发展前景[J].中国畜禽种业，2015，（12）：83-84.