接种菌剂对发酵床垫料中微生物数量与酶活性的影响

肖翰+雷平++刘标++许隽++杜东霞++尹红梅

摘要：以发酵床垫料与猪粪为原料，研究接种微生物菌剂对发酵床垫料中微生物数量和酶活性变化的影响。结果表明，接种菌剂试验组微生物数量高于对照组；接种菌剂提高了发酵床垫料温度，延长了高温保持的时间；接种菌剂有效地提高了发酵过程中各种酶的活性和峰值。酶活性的大小因酶种类和发酵时期的不同而各异，过氧化氢酶、纤维素酶在发酵初期活性高，B试验组、对照组过氧化氢酶活性峰值分别为8.26、4.72 U/g，纤维素酶活性峰值分别为 44.8、32.4 U/g；蛋白酶活性峰值出现在中期，B试验组、对照组蛋白酶活性峰值分别为36.2、27.6 U/g。

关键词：接种菌剂；发酵床；微生物数量；酶活

中图分类号： S815.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0157-02

随着我国养殖业的迅速发展，畜禽粪尿及污水排放造成的环境污染问题日趋严重，加强畜禽养殖污染的防治已迫在眉睫[1]。发酵床养殖技术是为了实现畜禽养殖零污染、零排放的新型养殖技术。我国从20世纪90年代后期引进和应用该技术，随后迅速蔓延开来[2]。该技术将稻壳、锯末屑、粉碎的农作物秸秆等垫料、多种不同功能的饲料级微生物和米糠、红糖等辅助发酵剂按一定比例混匀，铺在发酵舍内，自然发酵，形成微生物发酵床，将畜禽饲养其上，利用微生物对畜禽粪尿原位降解，达到生态环境零污染的目的。微生物对畜禽粪尿的分解代谢能力取决于酶的活性[3]，分解的底物越丰富多样，所需要的酶系统就越复杂[4]。本研究初步探讨接种微生物菌剂对发酵床垫料中微生物含量及部分酶活的影响，以期为微生物菌剂在发酵床垫料中的应用提供一些的理论依据。

1材料与方法

1.1菌剂

自制的A（枯草芽孢杆菌）、B（枯草芽孢杆菌+干酪乳杆菌）、C（干酪乳杆菌）3种菌剂，3种菌剂活菌总数均为1.0×109 CFU/mL。

1.2试验方法

1.2.1试验设计本试验在湖南省长沙市长沙县某猪场发酵床中进行。发酵床垫料由锯末屑、稻壳、稻草按5 ∶3 ∶2体积比配制而成，垫料深度约为70 cm，接种的菌剂按0.1%的量喷洒到垫料中，充分拌匀，含水率保持在55%左右。发酵床在夏季采用负压抽风降溫。设置添加微生物菌剂A、B、C 3个处理组和不加菌剂的对照组，每个处理3次重复。

1.2.2采样时间及方法本试验于2015年7月1日开始，分别在5、10、30、60、90、120 d采样，采样点位于垫料表层下20 cm处，采用5点采样法取样。

1.2.3分析项目及方法在每个试验组垫料20 cm处插温度计，每天11：30测温度；采用平板菌落计数法测定垫料中微生物总量；采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性[5]；采用酪氨酸比色法测定蛋白酶活性[6]；采用DNS法测定纤维素酶活性[7]。所有检测项目均为3个重复，取其平均值。

1.2.4数据统计分析采用SPSS 16.0对数据进行处理分析。

2结果与讨论

2.1发酵床垫料温度变化

温度是影响微生物活性的关键因素，且能很好地反映发酵所处的状态[8]。从图1可以看出，试验组与对照组垫料 20 cm 处温度变化趋势基本一致，可分为升温阶段、高温阶段、降温阶段与温度稳定阶段；试验组与对照组在50 ℃以上高温保持的时间不同，A、B、C试验组、对照组高温保持的时间分别为11、13、11、4 d；进行到20 d后，试验组20 cm处垫料温度一直维持在40 ℃左右，而对照组温度接近室温。可见试验组温度更利于微生物生长繁殖，从而有效地促进畜禽粪便中有机物的降解。统计分析表明，试验组A、B、C之间温度变化无明显差异，但试验组与对照组之间温度变化差异明显。

2.2发酵床垫料微生物含量变化

用平板计数法对发酵床垫料中微生物进行计数。由表1可知，在试验初期5 d，接种了有益微生物菌种的A、B、C试验组微生物数量迅速达到峰值，分别为5.8×1010、9.5×1010、23×1010 CFU/g，对照组微生物含量为7.2×109 CFU/g。这可能是因为发酵初期垫料中富含易分解的有机物，为中温和耐高温微生物提供丰富的营养，使其进行快速自身增殖，从而使其数量迅速增加。当试验进入15 d时，A、B、C试验组与对照组微生物数量分别为2.6×108、8.5×108、5.6×108、6.3×

107 CFU/g（表1），相对于初期微生物含量有大幅度下降，可能是由于连续高温和营养物质的消耗，大部分中温性微生物进入休眠或衰亡状态所致。试验进行到30 d后，中温微生物又开始大量繁殖，微生物数量有所上升。试验进行到90 d时，A、B、C试验组与对照组微生物数量分别为 9.2×108、1.6×109、6.5×108、4.8×107 CFU/g（表1），试验组垫料中微生物含量高，有利于畜禽粪尿的分解。试验过程中，A、B、C试验组微生物的数量始终比对照组高1个数量级以上，差异明显。

2.3接种菌剂对垫料中酶活性的影响

在发酵床养猪模式中，猪粪尿降解的生物化学过程都是在相关酶参与作用下进行的，故研究垫料中的酶活性，有助于了解垫料环境对猪粪尿降解能力的影响[9]。

2.3.1过氧化氢酶相关研究认为，过氧化氢酶活性与有机质及微生物含量有关。由图2可以看出，A、B、C试验组与对照组垫料中过氧化氢酶均呈先上升后缓慢下降的趋势，均在10 d达到最大值，分别为7.81、8.26、8.15、4.72 U/g，A、B、C试验组垫料之间的酶活性差异不明显，而各试验组的酶活性明显高于对照组。过氧化氢酶活性初期上升中后期缓慢下降，可能是因为初期垫料中有机质含量高，中后期有机质大量降解，微生物数量和种类减少[10-11]。

2.3.2蛋白酶蛋白酶是参与环境氮循环最重要的酶类之一，主要参与含氮物质的分解和氨基酸、蛋白质及其他含氮有机物的转化[12]。从图3可知，各处理蛋白酶活性变化趋势相同，初期垫料中蛋白酶迅速上升，中后期呈缓慢下降趋势；试验组A、B、C与对照组酶活均在30 d时达到最大值，分别为36.5、36.2、38.3、27.6 U/g，各试验组之间的蛋白酶活性差异不明显，但各试验组蛋白酶活性明显高于对照组，表明接种菌剂能提高发酵床垫料中的蛋白酶活性。

2.3.3纖维素酶纤维素降解与碳元素代谢紧密相关，纤维素酶是碳循环中重要酶之一，其活性变化可以间接反映堆肥发酵过程中碳素物质的降解情况[13-14]。本研究试验组和对照组纤维素酶活性均呈先迅速上升后逐渐下降的趋势（图4）。在发酵初期，微生物快速繁殖，纤维素酶活性不断上升，由图4可见，试验组A、B、C和对照组均在5 d达到峰值，分别为43.2、44.8、42.5、32.4 U/g，对照组与各试验组纤维素酶差异明显。试验进入高温期后，纤维素酶活性迅速下降，这可能是由于纤维素的主要分解菌——真菌不耐高温，大量死亡或者休眠所致。进入降温期后，酶活性下降趋势减缓。试验组纤维素酶活性在各取样点均明显高于对照组，可能是由于接种的外源菌剂对纤维素酶产生一定的促进作用。

3小结

接种菌剂能够加快发酵床垫料温度升高，延长高温保持的时间。A、B、C试验组与对照组高温保持的时间分别为11、13、11、4 d，试验组与对照组之间高温期间温度变化差异明显。

在试验过程中，试验组和对照组中的微生物总量变化趋势相似，均经历了升高—降低—升高的过程。但试验期间，A、B、C试验组微生物的数量始终比对照组高1个数量级以上，差异明显。

接种菌剂后能明显提高垫料的酶活性。整个试验过程中，试验组与对照组所检测的酶活性变化趋势相似，但所有试

验组的酶活性都比对照组的高，这说明接种菌剂可以提高垫料中相关酶的产生，加快有机质的分解和转化，有效促进猪粪尿的降解。

参考文献：

[1]杨朝飞. 加强禽畜粪便污染防治迫在眉睫[J]. 环境保护，2001（2）：32-35.

[2]黄振兴，陈谊. 猪粪尿“零排放”无污染研究与可行性探讨[J]. 上海畜牧兽医通讯，2001（6）：10-11.

[3]Castaldi P，Garau G，Melis P. Maturity assessment of compost from municipal solid waste through the study of enzyme activities and water-soluble fractions[J]. Waste Management，2008，28（3）：534-540.

[4]黄得扬，陆文静，王洪涛. 有机固体废物堆肥化处理的微生物学机理研究[J]. 环境工程学报，2004，5（1）：12-18.

[5]周礼恺. 土壤酶学[M]. 北京：科学出版社，1987：267-279.

[6]周景祥，王桂芹，余涛. 蛋白酶和淀粉酶活性检测方法探讨[J]. 中国饲料，2001（11）：23-27.

[7]中华人民共和国农业部. 有机物料腐熟剂：NY 609—2002[S]. 北京：中国标准出版社，2002：11.

[8]倪娒娣，陈志银，程绍明. 不同填充料对猪粪好氧堆肥效果的影响[J]. 农业环境科学学报，2005，24（增刊1）：204-208.

[9]朱洪. 基于畜禽废弃物管理的发酵床技术研究[D]. 南京：南京农业大学，2007：103.

[10]汪恒英，周守标，常志州，等. 接种一株嗜热球杆菌对堆肥腐熟进程的影响[J]. 江苏农业科学，2004（3）：78-81.

[11]Chang J I，Tsai J J，Wu K H. Thermophilic composting of food waste[J]. Bioresource Technology，2006，97（1）：116-122.

[12]戴芳，曾光明，牛承岗，等. 堆肥化过程中生物酶活性的研究进展[J]. 中国生物工程杂志，2005（增刊1）：148-151.

[13]沈其荣，王瑞宝，王岩，等. 堆肥制作中的生物化学变化特征[J]. 南京农业大学学报，1997，20（2）：51-57.

[14]倪治华，薛智勇. 猪粪堆制过程中主要酶活性变化[J]. 植物营养与肥料学报，2005，11（3）：406-411.