己烯雌酚人工抗原的合成及抗血清的制备

杨兴东++胡骁飞+王方雨++曾宪垠

摘要：由己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）经过一系列化学反应，合成含有1个羟基活性基团的半抗原己烯雌酚-单羧基丙基醚（DES-MCPE）；应用活泼酯法，使DES-MCPE与牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶联，合成人工免疫抗原DES-BSA和包被抗原DES-OVA，采用紫外分光光度法（UV）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定，初步判定偶联成功。用DES-BSA以60 μg/只的剂量免疫3只BALB/c小鼠，4次免疫后，采集血清，使用间接ELISA和间接竞争ELISA分别测定抗血清的效价与抑制，3只小鼠的效价均可达到1×104以上，其中2号小鼠的半抑制率（IC50）为18.221 μg/L，表明已获得灵敏、特异、高效价的抗血清。

关键词：己烯雌酚；完全抗原；人工合成；抗血清；ELISA；高效价；灵敏

中图分类号： S852.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0149-03

己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）是一种人工合成的非甾体雌激素，具有促进动物生长、提高瘦肉率的作用，曾经作为促生长剂在畜禽生产中得到普遍应用。但DES对人类有很强的致畸、致癌等毒副作用[1-3]，我国及大多数国家均明确规定禁止在畜牧养殖中使用DES。为降低动物生产成本，不规范使用己烯雌酚的现象仍然存在。传统的理化检测技术虽然能够监测动物源性食品中的DES残留，但其存在用时长、费用多、程序繁琐等缺陷，因此急需发展一种迅速、简便、敏感、精确、价廉的分析方法[4]。本试验旨在合成DES人工抗原和制备抗DES抗血清，为DES残留血清学检测的建立打下基础。

1材料与方法

1.1试剂和溶液

DES、4-溴丁酸乙酯，Sigma产品；羟琥珀亚酰胺（NHS）和N，N-二环己基碳二亚胺（DCC），Fluka公司；牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA），弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA），Pierce产品；羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG-HRP），华美生物工程有限公司；二甲基亚砜、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺均为AR级。

ELISA相关试剂配制：（1）洗液（PBST）：含0.05%的Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH值为7.4）；（2）间接ELISA和间接竞争ELISA所用的稀释液、封闭液均为含50 mL/L猪血清的PBST；（3）包被液（CBS）为 0.05 mol/L pH值9.6的碳酸盐缓冲液；（4）显色液为四甲基联苯胺（TMB）的醋酸-柠檬酸缓冲液；（5）终止液为2 mol/L的H2SO4溶液。

1.2主要仪器设备

U-3000紫外扫描仪（UV），日本岛津公司；凝胶成像系统及分析软件，Syngene公司；JM-250电泳仪，大连捷迈科贸有限公司；Bio-Rad 550型酶标仪，美国Bio-Rad公司；超净工作台，美国Forma Scientific公司；93-3定时恒温双向磁力搅拌器，上海亚荣生化仪器厂；3K-18高速冷冻离心机，德国SIGMA公司；HI9321酸度计，美国HANNA公司；Jouan-RC1010z真空浓缩仪，法国Jouan公司；AE260电子天平，德国METTLER公司。

1.3實验动物

SPF级6～8周龄的雌性BALB/c小白鼠，购自郑州大学医学院实验动物中心，由河南省农业科学院动物免疫学重点开放实验室饲养。

1.4方法

1.4.1DES人工抗原的合成

1.4.1.1己烯雌酚-单羧基丙基醚（DES-MCPE）的合成（1）精确称量54 mg DES溶于2 mL无水二甲基亚砜（DMSO），加入27.5 mg无水K2CO3，在避光条件下，室温搅拌反应1.5 h；（2）加入4-溴丁酸乙酯（C6H11BrO2）17 mg，室温，避光，搅拌反应8 h；（3）反应产物转移到10 mL预冷pH值 2.0 的稀盐酸溶液中，加入醋酸乙酯（C4H8O2）进行萃取，双蒸水冲洗、放入真空浓缩仪中，抽提有机溶剂；（4）抽提后的产物加入适量的甲醇（CH3OH）溶液进行溶解，再加入 2 mol/L 氢氧化钠溶液，全部溶解后后，逐滴加入适量的HCl溶液，使溶液pH值在2～4之间，重复上述分离步骤，C4H8O2萃取，双蒸水冲洗、真空干燥，得到目标产物（DES-MCPE）[5]。

1.4.1.2DES-BSA免疫原、DES-OVA包被原的制备（1）称取DE-MCPE 42 mg溶于2 mL二甲基亚砜（DMSO），将25 mg DCC溶解在0.6 mL无水二甲基甲酰胺，加入15 mg NHS，暗处、室温下搅拌反应4 h。（2）2 900 r/min离心 5 min，弃去沉淀，收集上清。（3）精确称量BSA 60 mg溶于 2 mL 的pH值8.0的PBS中，冰浴，逐滴加入1 mL无水二甲基甲酰胺。（4）将上清液缓慢逐滴滴加到BSA溶液中，4 ℃搅拌8 h。（5）将反应产物加入透析袋中，透析袋放入盛有 1 000 mL PBS缓冲液的烧杯中，将烧杯转移到4 ℃冷冻室开始透析，透析液需每天更换3次，持续透析3 d。（6）透析完成后，透析袋内溶液移入离心管，离心5 min，收集上清液，用1 mL PE管分装，-20 ℃存放待用。包被原DES-OVA的制备过程与DES-BSA相同，OVA的剂量为70 mg[6]。

1.4.2DES人工抗原的鉴定

1.4.2.1UV鉴定使用核酸蛋白检测仪DES-BSA溶液的质量浓度，用PBS配制BSA溶液使其浓度与DES-BSA溶液的浓度相同，用二甲基甲酰胺（DMF）与PBS体积比为4 ∶6的混液配制DES标准溶液，在波长220～350 nm之间，用紫外吸收法分别测定上述溶液的特征峰，通过观察吸收峰的特征变动，判定偶联成功与否，依据Yang等报道的方法[7]，推算出DES-MCPE分别与BSA、OVA的分子偶联比率。

1.4.2.2SDS-PAGE凝胶电泳鉴定电泳溶液的配制依照Guo等的报道[8]来进行：（1）浓缩胶ω=5%；分离胶ω=12%；浓缩胶电压65 V；分离胶电压100 V；（2）加入样品 20 μL，其中含免疫原3 μg；（3）考马斯亮蓝染色7～8 h；（4）在脱色液中脱色6～7 h；（5）可以通过测定物的分子质量的大小、条带位点的变化能够判定结合与否；（6）利用紫外凝胶成像系统分析软件，推算DES-MCPE与BSA的分子偶联比[9]。

1.4.3DES多抗血清的制备（1）用人工免疫原DES-BSA以60 μg/只的剂量，背部多点皮下注射的免疫方式来免疫3只实验小鼠；（2）第1次免疫，450 μL FCA和450 μL DES-BSA的无菌PBS溶液进行混合，利用匀浆机乳化5～10 min；（3）28 d后加强免疫，用450 μL DES-BSA的无菌PBS溶液与450 μL FIA混合并乳化，注射剂量与第1次免疫剂量相同，总共免疫4次，每次间隔时间为21 d；（4）第4免10 d后剪断免疫小鼠的尾稍，吸取10 μL血液放入装有990 μL无菌PBS的1 mL PE管中，在振荡器上振荡使之充分混合均匀，离心5 min，收集上清液，于4℃存放待用。

1.4.4DES多抗血清的鉴定

1.4.4.1效价测定采用间接ELISA测定DES抗血清效价[10]，其步骤如下：第1步，以DES-OVA为包被抗原（2 μg/L），50 μL/孔，进行包板，37 ℃温育2 h，PBST洗板4次（每次间隔3 min），下同；第2步，37 ℃，5%的猪血清以 220 μL/孔 的剂量封闭60 min，洗板；第3步：稀释100倍的DES抗血清以50 μL/孔的剂量加入第1孔，然后利用5%的猪血清进行倍比稀释，同时设阴性对照（negative control，NC）和空白对照（blank control，BC），37 ℃温育15 min，洗板；第4步：加入GaMIgG-HRP[V（GaMIgG-HRP） ∶V（封闭液）=1 ∶1 000]，50 μL/孔，37 ℃温育30 min，洗板；第5步：各孔加入TMB（四甲基联苯胺）的CH3COOH-C6H8O7缓冲液 50 μL，室温条件下静置2～6 min；第6步：各孔加入2 mol/L硫酸溶液50 μL，使反应结束，利用酶标仪进行测定；第7步，结果判断，以待测孔D450 nm≥NC D450 nm的2.1倍（P/N≥2.1），判为阳性。

1.4.4.2敏感性鉴定间接竞争ELISA（ci-ELISA）方法[11]测定抗血清对DES的半数抑制质量浓度（IC50），以IC50判定敏感度，操作步骤与间接ELISA类似，区别在于第3步分别添加D450 nm值为1.0的3只小鼠血清50 μL和不同质量浓度的抑制剂（DES溶液）50 μL。

1.4.4.3特异性测定交叉反应（CR）试验鉴定其特异性。选用己烯雌酚（DES）、己烷雌酚（HEX）、双烯雌酚（DIEN）和雌二醇（E2）等作为竞争物，用ci-ELISA测定各竞争物的IC50，交叉反应率（CR%）是以抗血清对DES的IC50与各竞争物的IC50之比的百分数。

2结果与分析

2.1人工抗原鑒定结果

2.1.1UV鉴定结果DES-BSA的吸收峰向右稍有偏移，DES的吸收峰在240～245 nm处，BSA的吸收峰在278～280 nm 处（图1），证明DES和BSA已发生偶联。推算出 DES-MCPE与BSA、OVA的分子偶联比分别为1 ∶12.8、1 ∶11.5。

2.1.2SDS-PAGE鉴定结果人工合成的DES-BSA的显色条带位于偶联物之后，其泳动速度小于DES（图2），DES分子质量的大小与样品在SDS-PAGE中迁移距离成反比，结果分析表明，DES-BSA的分子量比BSA的大，证明BSA与DES成功偶联；应用紫外凝胶成像系统分析软件推算出 DES-BSA的分子量为7.039×104，BSA的分子量为6.62×104，BSA与DES的分子结合比约为1 ∶12.8，与UV鉴定结果基本一致。

2.2DES pAb的鉴定结果

2.2.1间接ELISA检测结果表1显示，免疫的3只 BALB/c 小鼠的多抗血清的效价均达到1.0×104以上，证明DES多克隆抗体（pAb）滴度高，DES-BSA免疫原性良好。

2.2.2敏感性鉴定结果3只免疫小鼠的抗血清都有抑制生成（表2），其中抗血清抑制效果最优的是2号小鼠（图3），以2号小鼠抗血清的抑制浓度的对数值为横坐标，其对应的B/B0值为纵坐标进行绘图，曲线回归分析显示两者存在良好的线性关系，其线性回归方程为y=-0.397 5x+1.001 2，r2=0.977 3。据此回归方程能够计算出对DES抗血清的IC50为18.221 μg/L，证明所获得的DES抗血清的敏感性较高。

2.2.3特异性鉴定结果DES抗血清与己烷雌酚、双烯雌酚的交叉反应率分别为8.09%、3.63%，与其类似物无交叉反应（表3）。证明DES多抗血清拥有较好的选择性。

3讨论

3.1DES人工抗原的制备

依据DES免疫学测定技术的报道，归纳活化DES重要的手段有2种：一种是改造己烯雌酚中的酚羟基产生醚键；另一种是改造DES中的酚羟基形成酯键，对DES分子含有2个对称结构的酚羟基进行衍生反应，对其可直接与琥珀酸酐衍生使之生成具有交联功能基团的化合物，然后再与载体交联。要对其中一个酚羟基进行化学改造，必须从反应物的量上加以严格控制，按一定比例反应后，保证生成的产物是DES-HS。我们按照此法对DES进行多次改造，但结果没有新的产物产生。Liu等报道动物体内酯酶使机体内的酯键处于不稳定状态，而且免疫原性不理想[12]。本研究为了避免这一现象的产生，选取后一种连接方式。

3.2DES人工抗原的鉴定

核磁共振碳谱、IR、标记抗原示踪法[13]、UV[14]、聚丙烯酰胺凝胶电泳等是检测小分子抗原经常使用的方法，前2种方法能够很好地测出被检物质的化学式，但是操作者需要拥有辨析图谱的能力和相当程度的实际动手经历，而且检测成本高昂，第3种方法要求对小分子作标记，还要求检测合成抗原的放射强弱，操作过程步骤繁琐、所需时间长。使用后2种方法鉴定本试验合成的抗原，结果显示，DES与BSA已经发生偶联，断定两者是否发生偶联的关键是合成的DES-BSA抗原免疫BALB/c小鼠后，是不是生成了针对DES的抗体[15]。本试验测定的3只BALB/c小鼠的多克隆抗体的效价都在 1×104以上，都对DES有抑制，最佳的IC50为 18.221 μg/L，结果表明，本研究合成的抗原可以激发机体产生高亲和力的特异性抗体，充分证明该合成物是有效的。

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