吡唑醚菌酯与戊唑醇及其复配剂对葡萄炭疽病菌的毒力测定及田间防效

刘吉祥++吉沐祥++芮东明++杨勇++陈宏州+杨敬辉

摘要：为筛选防治葡萄炭疽病的高效低毒新型复配药剂，降低有效用药量，提高防治效果，防止与延缓抗药性的产生，采用菌丝生长速率法测定吡唑醚菌酯、戊唑醇及其复配制剂对葡萄炭疽病病菌的毒力，并通过田间试验评价它们对葡萄炭疽病的防治效果。结果表明：吡唑醚菌酯、戊唑醇及其质量比5 ∶1、3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5复配组合对葡萄炭疽病病菌的半最大效应浓度（EC50）分别为1.038 8、0.358 3、0.612 9、0.530 1、0.232 6、0.232 8、0.329 6 μg/mL；5种复配组合对葡萄炭疽病病菌的增效系数（SR）分别为1.29、1.33、2.29、1.84、1.22，其中以1 ∶1复配组合的增效作用最大。田间防效调查结果表明，25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂1 000、2 000、3 000倍液及430 g/L戊唑醇悬浮剂5 000倍液、250 g/L吡唑醚菌酯乳油2 000倍液对葡萄炭疽病防治效果分别为91.54%、90.80%、82.88%、76.43%、7410%，防治效果排序为25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂（简称复配剂）高浓度>复配剂中浓度>复配剂低浓度>430 g/L戊唑醇悬浮剂5 000倍液 >250 g/L 吡唑醚菌酯乳油2 000倍液。因此，吡唑醚菌酯、戊唑醇复配防治葡萄炭疽病增效明显，其中以质量比1 ∶1混合后对葡萄炭疽病增效作用最明显，果穗套袋前采用25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂1 000～2 000 倍液浸果防治葡萄炭疽病病害防效均达90%以上。

关键词：葡萄炭疽病；吡唑醚菌酯；戊唑醇；复配；抑制活性；田间防效

中图分类号： S436.631.1+5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0087-04

葡萄炭疽病别称晚腐病，主要是由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的[1-2]。在所有葡萄病害中，葡萄炭疽病是葡萄生产上最流行的，也是最重要的病害之一[3]，该病主要危害着色期或近成熟期的果实，果实发病后造成果粒变褐、软腐、易脱落，或形成僵果，不仅造成减产，而且严重影响果实的品质。葡萄炭疽病在我国各葡萄产区均有分布，尤其在我国南方葡萄产区，由于夏季高温高湿，更容易暴发葡萄炭疽病。一般情况下，该病造成葡萄产量损失可达5%以上，如遇潮湿、多雨年份易造成大流行，病穗率达50%～70%[4]，对我国葡萄产业造成了严重影响。目前生产上对葡萄炭疽病的防治方法主要以化学手段为主，常用农药主要是有机硫类和芳香类杀菌剂代森锰锌、福美双、百菌清等，以及苯并咪唑类杀菌剂多菌灵、甲基硫菌灵等。近年来，甾醇脱甲基抑制剂（DMI）类杀菌剂咪鲜胺、戊唑醇、苯醚甲环唑[5-6]等以及甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂嘧菌酯、吡唑醚菌酯等[7-8]也开始在该病害防治上得以应用。但是由于药剂的长期以及不合理使用，代森锰锌、福美双、多菌灵[9]乃至一些新型杀菌剂等均已产生了一定的抗药性，导致药剂对葡萄炭疽病的田间防效大幅下降[10-11]，有些药剂使用后的副作用问题、药害问题、污染问题明显[12]，已经不能适应现代葡萄产业的发展，不能保证葡萄生产的正常进行，筛选效率高、杀菌谱广、对环境友好的杀菌剂并提供合理安全的用药技术已经是葡萄生产中的迫切需求[13-14]。

药剂混合使用是植物病原菌抗药性治理对策之一[15]。合理混用可以扩大防治谱，提高防治效果，降低防治成本。目前已经明确，在多数情况下，2种不同作用机制的杀菌剂混合使用可在一定程度上延缓或阻止病原菌种群对杀菌剂的抗性发展[15-16]。吡唑醚菌酯是甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，其抑菌机制是作用于真菌线粒体呼吸链中的细胞色素bc1复合物，阻止电子传递，进而抑制真菌孢子萌发或菌丝生长，为新型高效广谱杀菌剂[17]。戊唑醇是一种高效、广谱、内吸性强的三唑类杀菌剂，具有低毒安全、高效广谱等特性，主要通过抑制病原真菌体内甾醇的脱甲基化，导致生物膜的形成受阻而发挥杀菌活性，属于甾醇脱甲基化抑制剂，对作物具有持久保护、治疗作用[18]。吡唑醚菌酯与戊唑醇作用机制各异，2种药剂混配既具有保护作用又具有治疗作用，或许有利于克服或延缓葡萄炭疽病病菌抗药性的发展，从而提高防治效果。为了进一步明确吡唑醚菌酯、戊唑醇混合物对葡萄炭疽病病菌是否具有增效作用，本试验进行了吡唑醚菌酯、戊唑醇的混合物联合毒力测定，并通过田间药效试验评价2种药剂混用对葡萄炭疽病的防治效果及产量的影响，旨在明确吡唑醚菌酯、戊唑醇复配对葡萄炭疽病病菌的毒力及最佳配比，以期为有效防治葡萄炭疽病提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验时间与地点

本试验于2014年4—7月在江苏丘陵地区镇江农业科学研究所中心实验室进行。

1.2供试菌株

葡萄炭疽病病菌（Glomerella cingulata），采自江苏省句容市华阳镇葡萄园，由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所植保研究室分离、鉴定、保存备用。菌株保存于马铃薯蔗糖琼脂（PSA）斜面上（4 ℃）。

1.3供试药剂

96%吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）原药，由江苏耘农化工有限公司提供；95%戊唑醇（tebuconazole）原药，由盐城利民农化有限公司提供。

1.4仪器设备

主要仪器与设备：电子天平（精确度0.1 mg）、GZP-300A培养箱（南京恒裕电子仪器厂）、直径为75 mm的培养皿、三角瓶、移液器、移液管、洗耳球、打孔器、接种刀等。

1.5室内抑菌活性测定

1.5.1药液的配制及浓度设计（1）母液配制：将96%吡唑醚菌酯原药、95%戊唑醇原药用适量丙酮溶解后加10%吐温80，配制成1 000 μg/mL母液，置于4 ℃冰箱中备用。

（2）各药剂单剂与复配剂的浓度设计：吡唑醚菌酯在含药PSA培养基中的浓度设计为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μg/mL；戊唑醇在含药PSA培養基中的浓度设计为3、1.5、0.75、0.375、0.187 5、0.093 75、0.046 88 μg/mL；吡唑醚菌酯·戊唑醇（复配质量比例5 ∶1、3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5）复配剂在含药PSA中的浓度设计均为5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25、0.078 13 μg/mL。单剂、复配剂的设计均为7个不同浓度梯度含药PSA培养基。

除母液外，所有试验药剂系列浓度的药液均为现配现用。

1.5.2试验方法采用菌丝生长速率法[19]测定药剂的抑制作用，将各单剂与复配剂的药液依次稀释至所需浓度，然后将1 mL药液与9 mL培养基在培养皿内混匀，制成含系列浓度药剂的PSA培养基，采用无菌水作空白对照，各处理重复4次。将保留的葡萄炭疽病病菌转接到PSA平皿中，在25 ℃下活化72 h，然后在近菌落边缘用打孔器制取直径为5 mm的菌饼，并转接到含药的PSA平皿、空白对照平皿中。25 ℃培养96 h，待对照中菌落长至约平皿直径的4/5时，采用十字交叉法量取菌落直径。

计算菌落直径均值，并按照下列公式计算菌丝生长平均抑制率：菌丝生长平均抑制率=[（对照菌落直径均值-处理菌落直径均值）/（对照菌落直径均值-接种菌饼直径）]×100%。取抑制率在5%～95%范围的数据，采用DPS 13.0专业版数据处理系统，计算药剂对葡萄炭疽病菌菌丝生长抑制的回归方程、EC50及其95%置信限。

1.5.3联合作用评价方法根据Wadley法[19]，计算增效系数（SR）。根据增效系数（SR）评价药剂混用的联合作用类型，即SR<0.5为拮抗作用，0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR>1.5为增效作用。相关公式如下：

式中：A、B为杀菌剂单剂；a、b为相应单剂在混剂中的比例，%；EC50（th）为混剂EC50理论值；EC50（ob）为混剂EC50实测值。

1.6田间防效试验

1.6.1试验点概况田间试验于2014年在镇江万山红遍农业园进行。葡萄品种为夏黑，树龄4年，栽培方式为篱架，栽培管理水平良好，当季内未使用其他相关药剂。

1.6.2试验设计将吡唑醚菌酯、戊唑醇按质量比1 ∶1的比例加工成为25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂。试验设25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂（江苏丘陵地区镇江农业科学研究所配制）1 000、2 000、3 000倍液（以下分别简称高浓度、中浓度、低浓度）和250 g/L吡唑醚菌酯乳油（巴斯夫欧洲公司）2 000倍液、430 g/L戊唑醇悬浮剂（盐城利民农化有限公司）5 000倍液、清水对照6个处理，每个处理重复3次，随机区组排列，每个小区供试葡萄树3株。

1.6.3统计方法果粒直径为1 cm时浸果处理，1 h后马上套袋，果实成熟后摘袋调查病果率。每个处理取10个果穗，调查并计录总果粒数、病果粒数，计算病果率及防治效果。

葡萄炭疽病以病果率表示各处理区的发病情况，相关公式如下：

病果率=病果数/调查总果数×100%；

防治效果=（对照区病果率-处理区病果率）/对照区病果率×100%。

2结果与分析

2.1室内抑菌活性测定研究

2.1.1吡唑醚菌酯、戊唑醇对葡萄炭疽病病菌菌丝生长的抑制作用从表1看出，当吡唑醚菌酯的浓度为0.156 25～10 μg/mL 时，对葡萄炭疽病病菌菌丝生长的抑制率为 22.03%～85.32%；当戊唑醇处理浓度为0.046 88～3 μg/mL时，对葡萄炭疽病病菌菌丝生长的抑制率为19.75%～82.53%。结果表明，2种杀菌剂对葡萄炭疽病病菌菌丝生长的抑制活性以及对葡萄炭疽病病菌菌丝生长的最低抑制浓度（MIC值）有差异。

2.1.2吡唑醚菌酯与戊唑醇复配对葡萄炭疽病病菌菌丝生长的抑制作用从表2看出，吡唑醚菌酯与戊唑醇复配组合不同处理浓度对炭疽病菌表现出不同程度的抑制作用；吡唑醚菌酯与戊唑醇5种复配组合的浓度为0.078 13～5 μg/mL时，5 ∶1、3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5配比的组合对葡萄炭疽病病菌菌丝生长的抑制率分别为16.46%～81.01%、21.02%～81.27%、29.88%～96.46%、31.65%～96.96%、23.05%～95.19%。

2.1.3吡唑醚菌酯、戊唑醇对葡萄炭疽病病菌的毒力测定和复配联合作用类型2种单剂、5种复配组合对葡萄炭疽病病菌的作用模型见表3，可以看出，浓度对数与防治效果（抑制率）的相关系数均≥0.993 2，说明防治效果（抑制率）的变异有99.32%或以上来自浓度对数的变异，表明用所得模型表

达浓度对数与防治效果（抑制率）的关系可行。

由表3还可见，吡唑醚菌酯、戊唑醇单剂对葡萄炭疽病病菌的EC50分别为1.038 8、0.358 3 μg/mL，戊唑醇对葡萄炭疽病病菌菌丝生长的抑制活性高于吡唑醚菌酯；吡唑醚菌酯与戊唑醇分别以质量比5 ∶1、3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5复配后对葡萄炭疽病病菌菌丝生长抑制的EC50分别为0.612 9、0.530 1、0.232 6、0.232 8、0.329 6 μg/mL，并且吡唑醚菌酯与戊唑醇分别以质量比1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5复配后对炭疽病病菌的抑制作用均强于单剂；5种复配组合对葡萄炭疽病病菌的增效系数（SR）分别为1.29、1.33、2.29、1.84、1.22，其中质量比为 1 ∶1 时增效作用明显。根据Wadley的评价法，吡唑醚菌酯与戊唑醇分别以质量比5 ∶1、3 ∶1、1 ∶5复配，增效系数（SR）在0.5～1.5之間，表现出相加作用；以质量比1 ∶1、1 ∶3 复配，增效系数分别为2.29、1.84，增效系数（SR）>1.5，表现出增效作用，其中以质量比1 ∶1复配的增效系数（SR）最高，为2.29。因此，从整体上判断吡唑醚菌酯、戊唑醇的复配剂对葡萄炭疽病病菌的抑制作用较好，并且推荐最佳复配质量比为1 ∶1。

2.2田间防治效果试验

为了进一步验证25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂对葡萄炭疽病的防治效果，特别进行了田间防治效果试验。从药后50 d采摘前调查结果（表4）可以看出，对于葡萄炭疽病防治效果，25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂1 000、2 000倍液极显著高于2个单剂，显著高于25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂 3 000 倍液，而25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂3 000倍液又明显高于2个单剂，其中25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂高浓度防效最高，为91.54%，均高于其他各处理，其次为中浓度防效，为90.80%，高于低浓度和各单剂，低浓度防效为8288%，高于430 g/L戊唑醇悬浮剂5 000倍液、250 g/L吡唑醚菌酯乳油2 000倍液，后二者防效分别为 76.43%、7410%，对照区发病果粒率仅为9.46%；从防治效果来看，基本排序为25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂（简称复配剂）高浓度>复配剂中浓度>复配剂低浓度>430 g/L戊唑醇悬浮剂5 000倍液>250 g/L吡唑醚菌酯乳油2 000倍液。由此可见，25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂防治葡萄炭疽病病害的建议浓度为1 000～2 000倍液。

3讨论与结论

炭疽病是全世界葡萄种植国家和地区广泛分布的一种重要病害， 它严重影响了葡萄的产量、质量。目前，生产上防治

该病害常用的药剂有苯并咪唑类的甲基硫菌灵、多菌灵、甾醇脱甲基抑制剂类（DMIs）的咪鲜胺、戊唑醇等。由于使用频繁，部分药剂已产生抗性，防效较差。李洋对辽宁省葡萄炭疽病病菌对多菌灵敏感性测定显示，某些地区已产生了抗药性较强的菌株[9]。吡唑醚菌酯、戊唑醇作为新型广谱杀菌剂，在炭疽病防治上已有报道[20]。目前，还没有关于葡萄炭疽病病菌对吡唑醚菌酯产生抗药性的报道，但吡唑醚菌酯是甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，作用位点单一，主要抑制病菌孢子萌发及菌丝生长所需能量的产生，属“高抗性风险”药剂[21]，长期使用容易产生抗药性。叶佳等研究表明，浙江省葡萄炭疽病病菌对DMIs类杀菌剂戊唑醇的抗药性发展迅速[22]。关于吡唑醚菌酯、戊唑醇复配剂对葡萄炭疽病的防治尚未见报道，吡唑醚菌酯、戊唑醇的复配可以在防治炭疽病上提供一种新的选择，避免长期单一大量使用同一种药剂加速葡萄炭疽病病菌抗药性的产生。

本研究采用室内毒力测定与田间药效试验相结合的方法，测试了吡唑醚菌酯、戊唑醇及其复配剂对葡萄炭疽病的防治效果。结果表明：通过室内毒力测定，吡唑醚菌酯、戊唑醇对葡萄炭疽病病菌均具有较好的抑菌活性，其中戊唑醇对葡萄炭疽病病菌菌丝生长的抑制活性又高于吡唑醚菌酯。在单剂毒力的基础上，结合不同杀菌剂的作用机制，选择甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂吡唑醚菌酯分别与三唑类杀菌剂进行不同配比的毒力测定。结果表明，其中有2个配比（1 ∶1、1 ∶3）表现为增效作用，其中吡唑醚菌酯、戊唑醇以质量比1 ∶1混合后对葡萄炭疽病病菌菌丝生长的抑制活性最高，增效作用最明显；其他配比均表现出相加作用。吡唑醚菌酯为最新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，具有很强的渗透性及局部内吸活性，而戊唑醇内吸性强，可以抑制病菌的再侵染，二者作用机制不同，复配后增效明显。本试验筛选出了具有明显增效作用的混剂，为葡萄炭疽病的田间防治奠定了基础。笔者将筛选出的新型混剂进行了田间小区试验，将吡唑醚菌酯和戊唑醇按质量比1 ∶1制成25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮液，结果表明，25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂1 000～2 000倍液对葡萄炭疽病的防效达到90%以上，效果最好，可在葡萄田间推广应用。室内毒力测定与田间药效试验结果基本相符，室内抑菌效果较好的复配剂组合在田间防效最高，其防效均在82%以上，明显优于对照药剂430 g/L戊唑醇悬浮剂、250 g/L吡唑醚菌酯乳油。在田间试验过程中，该药剂在试验浓度条件下对葡萄树安全，无药害发生。因此，25%吡唑醚菌酯·戊唑醇悬浮剂有望成为将来生产上防控葡萄炭疽病的首选药剂。

综合以上分析表明，吡唑醚菌酯、戊唑醇复配防治葡萄炭疽病可行，研究结果为生产中农药复配提供了试验依据，从而为葡萄病害的防治提供了新思路和新方法，具有较好的应用前景，但关于其抗药性等方面还有待进一步研究。

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