拟南芥ERA—1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

付世英++刘夏燕

摘要：将拟南芥ERA-1基因除信号肽外的剩余编码序列克隆到原核表达载体pET28a上，转化到大肠杆菌BL21 （DE3）中表达，发现表达的目的蛋白位于包涵体中，大量表达目的蛋白并用镍柱亲和层析法进行纯化，获得足量的重组蛋白后将其作为抗原免疫家兔，获得抗血清。用重组蛋白亲和纯化抗血清中的ERA-1多克隆抗体。利用野生型拟南芥、ERA-1敲除突变系和ERA-1过表达系的叶片总蛋白进行免疫印迹试验，检测ERA-1多克隆抗体的特异性，发现纯化后的ERA-1多克隆抗体（1 ∶1 000体积比稀释）能特异地检测到拟南芥中的ERA-1蛋白。本试验成功制备了ERA-1蛋白的多克隆抗体，可以用于今后对ERA-1基因功能的研究。

关键词：拟南芥ERA-1；原核表达；蛋白纯化；抗血清；多克隆抗体制备

中图分类号： Q946.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0033-03

ERA（Eecherichia coli ras-like protein，简称ERA）基因最早在大肠杆菌中发现，因其蛋白序列与真核生物的大鼠肉瘤（Ras）蛋白相似度高，所以命名为ERA[1]。但随后的研究表明，ERA与Ras蛋白序列相似性主要集中于N端的GTP酶结构域，而其C端与包括Ras在内的其他小GTP酶不具有同源性，因而把它列为一类新的小GTP酶。对大肠杆菌ERA功能的研究表明，该基因是大肠杆菌生存繁殖所必需的[2]。大肠杆菌ERA表达量降低突变体表现为细胞分裂异常、细胞增长呈丝状、拟核数目增多，表明ERA在染色体分离后，胞质分裂前发挥重要作用[3-4]。另有研究表明，ERA的C端能与核糖体16S RNA结合，对核糖体小亚基的组装成熟起重要作用[5-6]。细菌的ERA蛋白序列具有高度保守性，不同种类细菌的ERA蛋白可以互补大肠杆菌ERA的功能[7-8]。

真核生物的ERA基因起源于原核生物，真核生物的ERA蛋白序列與原核生物具有高度相似性，大多分布于线粒体或叶绿体中[9]。人类ERA同源蛋白ERAL1定位于线粒体[10]，能与线粒体12S rRNA结合，参与核糖体小亚基的组装[11]。ERAL1功能缺陷细胞从G1期进入到S期受阻，进而引发细胞凋亡[12]。拟南芥ERA家族有2个成员ERA-1及ERA-2，亚细胞定位研究表明ERA-1定位于叶绿体，而ERA-2定位于线粒体[13]。目前植物中ERA的功能尚未见报道，为了方便研究ERA-1在拟南芥叶绿体中的功能，将拟南芥ERA-1基因在大肠杆菌中表达，获得重组ERA-1蛋白经过纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。ERA-1多克隆抗体的成功制备，为后续研究ERA-1的生物学功能提供了条件。

1材料与方法

1.1材料

野生型拟南芥、era-1-1纯合突变体、ERA-1过表达株系（ERA-1OE-1、ERA-1OE-13、ERA-1OE-4、ERA-1OE-5）均为Columbia-0生态型背景，由笔者所在实验室保存。

试验中使用的限制性内切酶、T4连接酶等各种酶类均购自TaKaRa。琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒等购自天根生化科技（北京）有限公司。His标签蛋白纯化柱填料Ni琼脂糖凝胶6 Fast Flow购自GE Healthcare Life Science。完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂为Sigma公司产品；HRP标记的羊抗兔抗体G&R购自北京康为世纪生物科技有限公司；蛋白免疫印迹化学发光试剂盒购自Bio-Rad。其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

pBluescript-ERA-1为包含ERA-1基因编码区全长序列的重组质粒，该质粒及原核表达载体pET28a、大肠杆菌Top10感受态细胞和BL21（DE3）菌株均由笔者所在实验室保存。

1.2方法

1.2.1原核表达载体的构建以质粒pBluescript-ERA-1为模板，设计引物F1、R1，PCR扩增ERA-1除去叶绿体定位信号肽序列的剩余编码区序列。回收的PCR产物经BamHⅠ酶切后连入pET28a表达载体，转化大肠杆菌Top10。挑选阳性克隆提质粒，用BamHⅠ酶切鉴定是否有目的片段插入，再用HindⅢ酶切鉴定插入方向。将酶切鉴定正确的重组质粒送去测序，测序验证正确的重组质粒命名为pET28a-ERA-1。所用扩增引物序列为：F1，5′-CATGGATCCAAATCACATCTCCAGGCGCAC-3′；R1，5′-CATGGATCCCTACATAGCTCGGATCTGTCC-3′（下划线部分为BamHⅠ酶切位点）。

1.2.2重组蛋白的原核表达分析将重组质粒pET28a-ERA-1转化至BL21（DE3）宿主菌，挑取阳性单克隆，接种于含50 μg/mL卡那霉素的LB培养液中过夜培养，次日按体积比1 ∶100接种至25 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养液中，200 r/min、37 ℃摇床培养至D600 nm达到0.5～1.0，取1 mL诱导前菌液，离心，弃上清，沉淀重悬于500 μL裂解液[50 mmol/L NaH2PO4（pH值8.0）、300 mmol/L NaCl]中，留作诱导前对照。然后加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，简称IPTG，终浓度1 mmol/L），继续37 ℃摇培4 h，摇培结束后取出 1 mL 菌液，处理同诱导前的1 mL菌液。将剩余的诱导后的菌液离心，沉淀重悬于11.5 mL裂解缓冲液中，冰浴，超声波破碎，结束后离心，收集上清，将沉淀部分溶解在11.5 mL裂解缓冲液中。分别取5 μL诱导前菌体总蛋白、诱导后菌体总蛋白、诱导破菌后上清蛋白、诱导破菌后沉淀蛋白样品液进行10% SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白的表达形式。

1.2.3重组蛋白的大量表达和亲和纯化挑取含重组质粒pET28a-ERA-1的阳性克隆，按照“1.2.2”节中的方法摇培、诱导，获得1 L表达重组蛋白的菌液；破菌，离心，将获得的沉淀用含有8 mol/L尿素的裂解缓冲液溶解，离心，收集上清液。上清液经0.22 μm滤膜过滤后与1 mL Ni琼脂糖凝胶6 Fast Flow填料孵育30 min，然后转入层析柱中；用 20 mmol/L 咪唑洗脱液洗涤杂蛋白，然后依次用2 mL 咪唑液（100、200、400 mmol/L）洗脱重组蛋白，每个浓度的咪唑洗脱液分2管收集（1支管1 mL）。将不同浓度咪唑液洗脱的蛋白及025 mg/mL牛血清蛋白（BSA）进行SDS-PAGE电泳，以检测重组蛋白的纯度和浓度。

1.2.4抗血清的制备及验证将纯化后的ERA-1重组蛋白测定浓度，作为抗原免疫家兔。首免按200 μg/只，加入等体积弗氏完全佐剂涡旋混匀后，背部多点皮下注射[14]。之后每2周进行1次加强免疫，蛋白用量按100 μg/只，佐剂使用弗氏不完全佐剂。3次加强免疫之后，心脏采血并收集血清。

将纯化后的重组蛋白进行梯度稀释，然后分别取100、10、1 ng进行SDS-PAGE电泳。蛋白样品经半干法转移到硝酸纤维素膜上，封闭液（5%脱脂牛奶/TBST）室温封闭1 h后，加入经封闭液稀释的抗血清（1 ∶5 000）室温孵育1 h；用TBST[20 mmol/L Tris-HCl（pH值7.5）、150 mmol/L NaCl、0.1% Tween 20]洗涤3次；用HRP标记的羊抗兔IgG（1 ∶10 000 稀释）室温孵育1 h后，再用TBST洗涤3次；ECL显色处理，化学发光仪成像[15]。

1.2.5多克隆抗体的纯化将1 mg纯化后的重组蛋白进行10% SDS-PAGE电泳，转膜，番红染色。然后将重组蛋白条带从NC膜上切下，用100 mmol/L甘氨酸/HCl（pH值2.5）洗膜 5 min，然后用TBS[20 mmol/L Tris（pH值7.4）、500 mmol/L NaCl，005% Tween 20]洗2次，每次2 min。5%脱脂牛奶室溫封闭1 h后，取5 mL抗血清加入到5 mL TBS中，与膜在摇床上4 ℃过夜孵育。保留上清，将膜先用TBS洗涤2次，再用PBS[20 mmol/L磷酸钠（pH值7.2），150 mmol/L NaCl]洗涤2次。洗脱抗体时加入1 mL甘氨酸，孵育10 min，然后将洗脱液移入新管中并加入100 μL Tris（pH值8.0）使pH值调到7.0。

1.2.6植物叶片总蛋白中ERA-1的检测将拟南芥种子点种于泥炭营养土上，4 ℃放置2 d诱导种子萌发，然后在 22 ℃ 持续光照下培养。

当植物生长到2周大时，每株植物取2张真叶于1.5 mL离心管中，记录管中叶片的质量，液氮中研磨。根据管中叶片的质量，加入对应体积的蛋白抽提液[0.125 mg/L Tris（pH值6.8）、20%葡萄糖、4% SDS、1% β-巯基乙醇]，使得蛋白抽提液终浓度为0.1 mg/μL，充分研磨成匀浆；最后将样品于 65 ℃ 加热2 h，离心，取上清。将上清及10 ng重组蛋白进行10% SDS-PAGE电泳，用“1.2.5”节中纯化得到的多克隆抗体（1 ∶1000稀释）进行蛋白免疫印迹检测。

2结果与分析

2.1重组质粒pET28a-ERA-1的构建

阳性质粒酶切鉴定结果如图1所示，用BamH Ⅰ酶切鉴定，获得的质粒骨架及插入片段大小符合预期（1.16、5.3 kb）；用Hind Ⅲ鉴定是否为正向插入（插入片段和pET28a质粒上各有1个Hind Ⅲ酶切位点，若正向插入两者距离约为1.08 kb），酶切结果符合正向插入。将酶切鉴定正确的质粒送去测序，所测得的序列与预期完全一致。

2.2目的蛋白在大肠杆菌中的表达分析

将构建好的重组质粒pET28a-ERA-1转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，挑取单菌落接种于LB培养基上，培养至对数生长期时加IPTG诱导，收集诱导前及诱导后的菌体经10% SDS-PAGE检测。结果如图2中1、2泳道所示，与诱导前相比，诱导后的菌液在50 ku附近多出明显的蛋白条带，符合预期，说明目的蛋白已成功表达。在进行大量表达和纯化之前，须对目的蛋白的可溶性进行分析，因此将诱导后的大肠杆菌细胞经超声破碎，分离上清液和沉淀，并将沉淀溶于裂解液中，进行SDS-PAGE电泳，结果如图2中3、4泳道所示，所表达的重组蛋白质几乎全部在沉淀中，以包涵体的形式存在。

2.3Hisx6-ERA-1蛋白的大量表达与亲和纯化

在获知重组蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在后，开始大量诱导表达重组蛋白，并将获得的包涵体溶解于含 8 mol/L 尿素的裂解液中，通过镍琼脂糖亲和柱分离，再用不同浓度的咪唑液洗脱。SDS-PAGE结果如图3所示，第1支管100 mmol/L咪唑洗脱液（泳道4）中的目的蛋白浓度最高，用0.25 mg/mL BSA对该管洗脱液中的蛋白浓度进行粗定量，结合软件分析其蛋白浓度大于1 mg/mL，可用于后续免疫家兔试验。

2.4抗血清的制备与检测

利用纯化得到的Hisx6-ERA-1重组蛋白免疫家兔，将获得的抗血清作免疫印迹试验，分析其结合抗原有效性。结果表明，Hisx6-ERA-1抗血清1 ∶5 000稀释后，能够清晰地检测到10 ng的Hisx6-ERA-1重组蛋白（图4）。

2.5免疫印迹法检测植物叶片总蛋白中的ERA-1

用ChloroP预测表明，具有427个氨基酸残基的ERA-1蛋白的前39个氨基酸残基为叶绿体定位信号肽，切去前39个信号肽的成熟野生型ERA-1蛋白的分子量约为 42.88 ku，而pET28a-ERA-1载体表达的加上Hisx6标签的重组ERA-1蛋白大小约为47.9 ku。提取WT、era-1-1纯合突变体及ERA-1过表达株系ERA-1OE-1、ERA-1OE-13、ERA-1OE-4、ERA-1OE-5的叶片总蛋白，并用10 ng的Hisx6-ERA-1重组蛋白抗原作为阳性对照，与经重组蛋白Hisx6-ERA-1亲和纯化过的多克隆抗体（1 ∶1 000稀释）进行免疫印迹试验。结果如图5所示，野生型、过表达株系在预期分子量大小（42.88 ku）位置附近出现了2条带，而era-1-1纯合突变体没有对应条带。野生型、过表达株系都出现2条特异性条带，说明ERA-1在植物体内可能有2种不同的存在形式。本试验所制备的多克隆抗体能清晰地检测到植物叶片总蛋白中的ERA-1，并在负对照era-1-1突变体中无特异性带的产生，可满足后续试验的需求。

3结论与讨论

ERA基因在原核生物及真核生物中广泛存在，并具有很高的保守性。对大肠杆菌及人的ERA的研究都表明，ERA在核糖体小亚基的成熟过程中起重要作用，参与细胞周期调控，然而ERA蛋白在植物中的功能却鲜有报道。本试验通过原核表达重组蛋白，抗体制备和抗体的亲和纯化成功获得了拟南芥ERA-1蛋白的多克隆抗体，为后续深入研究植物 ERA-1的生物学功能提供了条件。

参考文献：

[1]Ahnn J，March P，Takiff H，et al. A GTP-binding protein of Escherichia coli has homology to yeast RAS proteins[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1986，83（23）：8849-8853.

[2]Chen X，Chen S，Powell B，et al. Purification，characterization and crystallization of ERA，an essential GTPase from Escherichia coli[J]. FEBS Letters，1999，445（2/3）：425-430.

[3]Britton R，Powell B，Dasgupta S，et al. Cell cycle arrest in Era GTPase mutants：a potential growth rate-regulated checkpoint in Escherichia coli[J]. Molecular Microbiology，1998，27（4）：739-750.

[4]Britton R，Powell B，Court D，et al. Characterization of mutations affecting the Escherichia coli essential GTPase era that suppress two temperature-sensitive dnaG alleles[J]. Journal of Bacteriology，1997，179（14）：4575-4582.

[5]Sayed A，Matsuyama S，Inouye M. Era，an essential Escherichia coli small G-protein，binds to the 30S ribosomal subunit[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1999，264（1）：51-54.

[6]Tu C，Zhou X，Tarasov S，et al. The era GTPase recognizes the GAUCACCUCC sequence and binds helix 45 near the 3' end of 16S rRNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（25）：10156-10161.

[7]Zuber M，Hoover T，Dertzbaugh M，et al. A francisella tularensis DNA clone complements escherichia coli defective for the production of era，an essential ras-like GTP-binding protein[J]. Gene，1997，189（1）：31-34.

[8]Pillutla R，Sharer J，Gulati P，et al. Cross-species complementation of the indispensable Escherichia coli era gene highlights amino acid regions essential for activity[J]. Journal of Bacteriology，1995，177（8）：2194-2196.

[9]Suwastika I N，Denawa M，Hata A，et al. Energy from the Sun[M]. Netherlands：Springer Netherlands，2008：1137-1140.

[10]Dennerlein S，Rozanska A，Wydro M，et al. Human ERAL1 is a mitochondrial RNA chaperone involved in the assembly of the 28S small mitochondrial ribosomal subunit[J]. The Biochemical Journal，2010，430（3）：551-558.

[11]Uchiumi T，Ohgaki K，Yagi M，et al. ERAL1 is associated with mitochondrial ribosome and elimination of ERAL1 leads to mitochondrial dysfunction and growth retardation[J]. Nucleic Acids Research，2010，38（16）：5554-5568.

[12]Akiyama T，Gohda J，Shibata S，et al. Mammalian homologue of E. coli Ras-like GTPase （ERA） is a possible apoptosis regulator with RNA binding activity[J]. Genes to Cells：Devoted to Molecular & Cellular Mechanisms，2001，6（11）：987-1001.

[13]Suwastika I，Denawa M，Yomogihara S，et al. Evidence for lateral gene transfer （LGT） in the evolution of eubacteria-derived small GTPases in plant organelles[J]. Frontiers in Plant Science，2014，5：678.

[14]李芳，羅军，许会芬，等. 西农萨能羊MAT基因的原核表达及多克隆抗体制备[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2014，42（12）：1-6，12.

[15]Yu F，Park S，Liu X，et al. Suppressor of variegation4，a new var2 suppressor locus，encodes a pioneer protein that is required for chloroplast biogenesis[J]. Molecular Plant，2011，4（2）：229-240.