绵羊Toll样受体7基因多态性分析

梁田++杨霞++张勋++肖媛媛++陈新凯++宋佳玮++盛金良

摘要：对新疆萨福克羊Toll样受体7基因单核苷酸进行多态性分析，探索绵羊TLR7基因多态性与抗病力的关系，为家畜抗病育种提供候选分子标记。采集新疆地区种羊场萨福克羊血液600份，提取DNA，设计扩增引物进行聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）检测，对突变位点进行测序分析。结果表明，12对扩增引物中，第2、5、6、7对引物扩增产物具有多态性。其中第2对和第7对引物扩增产物存在错义突变，第5对和第6对引物扩增产物存在同义突变。经SSCP分析，第2对引物扩增产物表现为3种带型，第7对引物有2种带型.经序列比对分析存在A343G、A350G、A1244G的错义突变，氨基酸改变分别是Lys突变为Gln，Asp突变为Ser，Glu突变为Arg，且突变都发生在胞外区亮氨酸重复区内。其中第2对引物的带型AB是位点A343G和A350G同时发生突变。位点A343G的突变频率最高为45.0%，A350G突变频率12.0%，而A1244G突变频率为5.8%。检测的突变可能改变TLR7基因的功能，进而影响其对病源的免疫应答。为进一步的疾病相关的研究奠定基础，以调查这些研究结果在家畜育种方面的用处。

关键词：Toll样受体7；多态性；萨福克羊；基因型

中图分类号： S826.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0026-04

先天性免疫系统是生物进化过程中1种比较古老而保守的防御体系，是抵御病原微生物感染和有害物质侵害的第一道防线，而广泛模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）[1]是先天性免疫系统执行识别潜在的病原微生物和非致病性共生菌群，并清除病原微生物的重要受体。PRR包括NK细胞活化受体、清道夫受体、甘露糖受体和Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）。这些受体中，TLRs是最为重要的受体，能够识别不同病原微生物所携带的特异性结构成分，即病原相关分子模式（patho-gen-associated molecular patterns，PAMPs）。在家畜中，已经检测到10种功能性TLR基因[2]。TLR3、TLR7、TLR8、TLR9能够识别细胞内的病原体表达的配体。其中TLR7属于Ⅰ型跨膜蛋白受体，具有与其他TLR家族成员共同的结构特征，其分子结构由胞外区、跨膜区和胞内区组成。其存在于多种细胞中，包括浆细胞样树突状细胞（pDC）、巨噬细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和内皮细胞中也有一定水平的表达[3-5]。另外，在扁桃体、脾、胎盘、骨髓、肺和淋巴结等组织中也有表达[6]。1996年，Hofmann 等证实克隆果蝇Toll样受体能识别并抑制真菌繁殖[7]。随后，人们发现Toll样受体在天然免疫系统和获得性免疫中起着重要的作用。TLRs信号转导途径主要包括依赖MyD88的信号通路和非依赖MyD88的信号通路。TLR7能够通过依赖MyD88的信号通路激活免疫细胞，并诱导免疫细胞表达高水平的干扰素、肿瘤坏死因子-α、IL-12 等细胞因子，介导抗病毒免疫。TLR7胞外区负责识别和接受相应信号，随后TIR位点招募富含Toll/白介素1受体接头蛋白分子，启动下游信号分子，最终杀伤感染的病原体[8-9]。通过TLR7的作用，机体能激发天然免疫与获得性免疫，有效地防御来自外部环境的病原体感染，维持机体内环境的稳定。

基因多态性与机体对疾病的遗传易感性相关。Toll 样受体在识别病原微生物启动免疫应答中起重要作用。越来越多数据表明，TLRs单核苷酸多态性与炎性应答损伤及感染性疾病的遗传易感性相关，如TLR4 基因Asp299Gly和Thr399Ile SNPs与多种感染性疾病正相关，在动脉粥样硬化及其相关疾病中则起保护作用[10]。研究表明，当动物面对体外环境（空气灰尘较多）和体内环境（细菌入侵）的变化，会作出适应性反应，由于TLR 配体可能会受到 Toll 样受体基因单核苷酸多态性的影响，导致对细菌感染或炎症性疾病易感性的改变[11]。目前，绵羊TLRs的多态性研究较少，其与疾病关系还不十分清楚。本研究通过PCR-SSCP分析及其基因突变频率分析，研究绵羊Toll样受体7胞外区基因的多态性，为今后绵羊育种的标记辅助选择提供确切的遗传学证据。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器

丙烯酰胺、双丙烯酰胺、TEMED、2×Taq PCR MasterMix，均购自上海生工生物工程有限公司；DNA提取试剂盒购自北京天根生物工程有限公司；DNA凝膠回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。其他常规试剂来自于石河子大学动物科技学院病理实验室。

DYC系列电泳仪、水平电泳槽、垂直电泳槽，均购自北京市六一仪器厂；脱色摇床，购自江苏省会坛市医疗仪器厂；PCR仪、凝胶成像系统为美国生产。

1.2试验动物与样品采集

分别在新疆维吾尔自治区昌吉市和玛纳斯县某种羊场分别随机采集200、400份萨福克羊血液样本，用颈静脉采血法，每只羊采5 mL血液，用肝素钠采血管带回实验室，4 ℃保存备用。

1.3DNA的提取

采血管中的羊血用试剂盒进行DNA提取，-20°保存备用。

1.4引物的设计与合成

采用文献报道的12对引物[12]，送上海生工生物工程有限公司合成，扩增片段200～400 bp。

1.5PCR扩增

PCR扩增体系25 μL：上游引物和下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，1×LightScannerMaster 12 μL，超纯水9 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性35 s，退火30 s（退火温度见表1），72 ℃延伸30 s，33个循环；72 ℃延伸 10 min；4 ℃ 保存。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6PCR-SSCP分析

1.6.1制备8%非变性聚丙烯酰胺凝胶首先将玻璃板洗净、擦干，玻璃板的两边放上塑料胶条，用夹子固定在架子上，1.5%琼脂糖封底，防止漏胶。配置8%非变性聚丙烯酰胺凝胶：加入丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺体积比为29 ∶1 的30%丙烯酰胺贮备液16 mL，5×TBE 12 mL，ddH2O 32 mL，10%过硫酸铵500 μL，N，N′—二甲基乙二胺（TEMED） 30 μL，混合后将配好的8%凝胶液缓慢倒入两玻璃板之间，插上梳子，室内聚合2 h后，拔掉梳子，用针管冲洗点样孔，向电泳槽中加入1×TBE电泳缓冲液。

1.6.2SSCP电泳取3 μL PCR产物，8 μL变性剂（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.025%溴酚蓝和0.025%二甲苯青），经98 ℃变性10 min，然后置于冰上10 min，每孔加样 10 μL，在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳12～16 h，银染显带，并拍照分析。

1.7PCR产物测序

SSCP分析后，选取不同基因型个体，将其进行PCR扩增胶回收，将纯化回收的目的片段吸取5 μL于小EP管中，分别加入0.5 μL的T4 DNA Ligase、0.5 μL的 PGEM-T Easy、4 μL 的Buffer，吹打混匀，室温放置1 h，之后4 ℃孵育过夜。将连接产物转化到感受态细胞中，筛选阳性克隆后送上海生工生物工程有限公司测序。

1.8数据统计分析

用DNAMAN （V 5.2.10）将测得的序列与GenBank已登录的绵羊的TLR7基因序列分别进行比对。使用卡方分析SPSS 13.0软件进行差异显著性检验，对群体多态性分布及基因频率进行统计分析。

2结果与分析

2.1TLR7基因胞外区多态性

本研究对TLR7基因胞外区扩增产物进行SSCP分析，结果发现，第2对引物扩增的胞外区产物有3种带型（图1-a），第5、6、7对分别具有2种不同带型（图1-b、图1-c、图1-d）。从表2中可以看出，AA、AB、BB、CC、DD、EE、FF、GG、HH基因型频率分别是0.55、0.33、0.12、0.13、0.87、0068、0.932、0.942、0.058。对第2对引物带型进行χ2 适合性检验，发现χ2值差异极显著，该基因位点在绵羊群体中哈迪-温伯格平衡处于非平衡状态（表2）。

2.2TLR7基因胞外区的点突变

经测序发现，绵羊TLR7胞外区共有5个点突变，包括3个错义突变和2个同义突变。在343位核苷酸的改变导致了Lys115Glu，350 位核苷酸的改变导致了Asn117Ser，1244位核苷酸的改变导致了Gln415Arg。115位氨基酸的改变使电荷由正变负（表3），415位氨基酸的改变使其带上正电荷，这3个突变都发生在胞外区的亮氨酸重复区外的区域。

2.3TLR7基因多态性频率分析

根据PCR-SSCP的结果，600只萨福克羊的TLR7存在多态性，其分布情况见表2。其中343位核苷酸突变频率最高，达45%；其次350位核苷酸突变频率是12%，864位核苷酸突变频率是13%，突变频率最少的是1 244位核苷酸突变，突变频率是5.8%（表3）。

3讨论

本研究发现TLR7基因胞外区有5个点突变，包括3个错义突变和2个同义突变，证明了TLR7基因高度保守。其中突变带型AB的频率是33%，是突变带型中频率最高的，然后是突变带型CC（13%）、BB（12%），其他的突变带型频率都小于10%。在AB 和BB条带中都存在343位核苷酸的突变，突变频率为45%，经检测分析该基因位点不处于Hardy-Wernberg平衡状态，可能由于人工饲养，受育种选择的影响。

绵羊的TLR7由1 046个氨基酸残基组成，TLR7 的胞外区由LRR区和LRR区外的基序组成，LRR区在胞外区的内部，而LRR区外的基序形成胞外区凸表面[13]。这种凸表面可能影响病原相关分子模式（PAMP）与TLR 的结合[14]。本研究发现的115和415位的氨基酸突变都是在绵羊TLR7 的LRR区外的基序上，也导致了氨基酸极性和带电荷量的改变，这种替换极可能会影响TLR7 的结构或功能，从而改变对疾病的易感性。由于同义突变可能通过影响mRNA稳定、翻译和蛋白质的折叠[15-16]影响TLR7 的功能，本研究也分析了同义突变，有研究表明TLR7能够识别单链RNA病毒，包括水泡口腔咽喉病毒和流感病毒[17]。TLR7单核苷酸多态性与丙型肝炎病毒感染引起的炎癥反应密切相关。研究显示，TLR7的遗传变异影响丙型肝炎病毒感染后的免疫反应[18]。同样的，羊的梅迪维斯纳病毒易感性差异可能与TLR7多态性有关。TLR7也能被自身的RNA活化，引起自身免疫性疾病[19] 。在狼疮小鼠模型中Toll样受体7与此病的风险性直接相关[20-21]。研究表明，TLR7的激动剂能增强T细胞免疫和固有免疫，诱导TLR7表达肿瘤凋亡来抗肿瘤[22]。大量研究表明肿瘤细胞表面表达多种 Toll样受体与肿瘤细胞的生长转移有关。在这一领域未来的研究需要检测TLR7基因多态性与绵羊群病毒感染易感性的关系。

综上所述，TLR7识别病毒单链RNA介导抗病毒免疫应答，在自身免疫性疾病和一些肿瘤的发生中也有一定的作用，这些均提示TLR7在治疗病毒感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤疾病的重要作用。本研究探讨绵羊TLR7胞外结构域的区域的遗传变异，这些研究结果可以用来进一步探察遗传易感性羊感染疾病与TLR7基因变异的关系。通过基因图谱分析估计疾病的危险因素，也可用于育种计划中增加羊群的天然抵抗力。

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