饲料中添加嗜水气单胞菌对日本医蛭生长和成活的影响

张涛+于翔+龚元+李军+张健

摘 要：在水温21.3～27.5 ℃条件下研究了两种不同基础饲料配比不同浓度的嗜水气单胞菌后，日本医蛭（Hirudo nipponia）增重率、饲料系数和存活率的变化。结果表明，以新鲜猪血为基础饲料配比试验，试验2#、3#组日本医蛭总增重率分别为804.99%±56.16%和682.33%±43.11%，高于其余各组；试验2#组的总饲料系数为2.71±0.32，低于0#、1#组，试验3#组饲料系数最低为2.61±0.19 ；试验2#、3#组日本医蛭存活率分别为93%±4.23和96.00%±0.00%，高于其余各组。以人工配合饲料为基础饲料配比试验，试验1#、2#组日本医蛭总增重率分别为102.33%±12.12% 和114.33%±14.81%，高于其余各组；试验1#、2#组总饲料系数分别为3.57±0.31和3.41±0.25，低于其余各组；试验1#、2#组日本医蛭存活率分别为88.00%±5.64%和87.00%±4.23%，高于其余各组。

关键词：日本医蛭（Hirudo nipponia）；嗜水气单胞菌；增重率；饲料系数；存活率

日本医蛭（Hirudo nipponia Whitman，1886）属于医蛭科（Hirudinidae Whitman，1886），医蛭属（Hirudo Linnaeus，1758），别名水蛭、稻田医蛭。此种以人、牲畜和蛙的血液为食，在我国分布较广，江苏、山东、湖北、四川、吉林、河南、内蒙古、辽宁等地均有发现[1]。日本医蛭属于吸血类水蛭，其体内含有水蛭素（Hirudin）[2，3]。水蛭素最早是从欧洲医蛭（Hirudo medicinalis）体内发现并分离鉴定的[4，5]，具有抗凝、抗血栓、纤溶性和降血脂等作用。Kim 等[6]报道了水蛭素在预防和治疗心血管病方面的功效。日本医蛭又是一种重要的中药材，我国明朝李时珍的《本草纲目》已有记载，主要用来治疗跌打损伤、女子月闭及产后血晕等症状。

近年来，由于日本医蛭的医用价值和经济价值，人类乱捕乱抓现象极其严重，天然种群数量不断减少，为保证其自然资源的稳定性和可持续性，人工养殖势在必行。目前，人工养殖日本医蛭因密度大，导致疾病频发，死亡率高，而日本医蛭中的肠道工程菌具有分解蛋白质和脂肪、吸收血细胞、调节肠道微生物种群、预防疾病等特点[7]。因此，本试验以前期实验为基础，在日本医蛭的饲料中加入不同浓度的肠道工程菌，从而检验肠道工程菌对日本医蛭增重率和成活率的影响，确定肠道工程菌与日本医蛭饲料的最佳配比浓度，为日本医蛭及其他吸血类水蛭的人工养殖及疾病预防提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

日本医蛭在辽宁省辽中县周边有河沟的地区采集，健康无病，平均每条体质量0.24 g。采集的日本医蛭暂养至580 mm×380 mm×250 mm的60目网箱中，网箱置于同等大小的聚乙烯塑料箱中，并加入曝气24 h以上的自来水，并以此作为日本医蛭的养殖用水，其水温21.3～27.5 ℃，pH 为7.2～7.4 ，溶解氧为6.02～9.13 mg/L，空气湿度为48%～71.5%RH。

1.2 肠道工程菌的分离与鉴定

随机挑选暂养的日本医蛭，经10 mg/L聚维酮碘消毒5 min，高压灭菌麻醉剂[8]麻醉后，腹部朝上固定到酒精消毒的解剖盘上解剖，解剖后消化道的内容物用无菌生理盐水清洗，再用无菌棉签在肠道内壁擦拭后，涂布到血琼脂培养基[9]上，经37 ℃培养箱培养48 h后，培养出的细菌通过16S rDNA-1500 bp测序快速鉴定菌种，鉴定的菌种为肠道共生菌（图1、图2）。根据前期实验确定的菌种的种群数量选取肠道共生菌中的优势菌种S2作为试验用肠道工程菌，其中菌种S2的DNA序列通过NCBI-Blast比对与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）相似度达到99.4%，因此确定S2菌种为嗜水气单胞菌。

1.3 试验动物分组

挑取饥饿健康的日本医蛭进行分箱试验，每箱50尾医蛭，并设有3组平行，其平均体质量≥0.2 g；以医蛭消化道上分离出来的嗜水气单胞菌为菌种来源，通过血平板培养基培养，制得2.4×108 cfu/mL嗜水气单胞菌，再分别以新鲜猪血和人工饲料（见表1）为基础饲料配比不同浓度的嗜水气单胞菌作为本次试验的考察因素（表2），以日本医蛭增重率、饲料系数、存活率做评价指标；并以对照0#组为参照，优选日本医蛭肠道工程菌与食用饲料的最佳配比浓度。

1.4 日本医蛭养殖管理

日本医蛭养殖采用室内网箱水养法，把日本医蛭放入380 mm×275 mm×140 mm的60目网箱中，网箱置于同等大小的聚乙烯塑料箱中，并加入曝气24 h的养殖用水，将猪血和人工饲料分别配比成含有不同浓度的嗜水气单胞菌，然后灌制猪大肠放入网箱中投喂，投喂饲料按照每箱日本医蛭200 ml量投喂。养殖周期为30 d（2015年8月19日至2015年9月22日），投喂频率为1次/5 d，共计6次。试验中注意观察医蛭饱食后状态及其活动。试验期间，保持室内安静，通风良好，观察医蛭存活情况，及时挑出病蛭及死蛭（根据养殖情况及時换水），保持清洁的养殖环境及一定的湿度。

1.5 日本医蛭样品采集与数据分析处理

试验开始前，选取暂养后日本医蛭100尾，称量日本医蛭总体质量（精确到0.01 g），计算日本医蛭个体平均体质量，称量前用润湿的纱布除去蛭体表附着的脏物和水分。试验分组后，测定每箱日本医蛭的总体质量。在试验期间，每次饲料投喂前后按试验分组分别统计存活日本医蛭尾数以及存活日本医蛭总体质量，计算日本医蛭体质量增长率、饲料系数和成活率，最后按照日本医蛭体重增重率、饲料系数、存活率综合指标值确定嗜水气单胞菌与日本医蛭饲料的最佳配比浓度。

试验描述结果数值用“平均值±标准差（Mean±SD）”表示，采用SPSS13.0在a=0.05水平下进行统计分析，数据经方差分析后进行组间两两（LSD）比较和显著性检验。质量增长率、饲料系数和成活率见公式一、二、三。

W1：每次饲料试验投喂前医蛭的个体体质量（g），W2：每次饲料试验投喂5 d后医蛭的个体体质量（g），W3：每次饲料试验投喂后医蛭的个体体质量（g），S1：试验开始时医蛭的尾数（尾），S2：每次饲料试验结束时医蛭的尾数（尾）

2 结果

2.1 以新鲜猪血为基础饲料配比不同浓度的嗜水气单胞菌对日本医蛭各项评价指标的影响

由表3可知，第一次饲料试验，试验各组体重增长率明显高于后几次饲料试验，各组在试验期间体重增长率有一定差异，试验2#组日本医蛭总增重率最高，为804.99%±56.16%，显著高于0#、1#、4#组（P<0.05），其次是3#组，为682.33%±43.11% 。由表4可知，各组在试验期间日本医蛭饲料系数有一定差异，但试验后2#组的总饲料系数低于0#、1#组，为2.71±0.32，但并不显著（P>0.05），最低是3#组，为2.61±0.19。由表5可知，各组在试验期间日本医蛭存活率有一定差异，试验2#、3#组日本医蛭存活率高于其余3组，分别为93%±4.23%，96.00%±0.00%，显著高于4#组（P<0.05）。

2.2 以人工配合饲料为基础饲料配比不同浓度的嗜水气单胞菌对日本医蛭各项评价指标的影响

由表6可知，第一次和第二次饲料试验，试验各组体重增长率明显高于后几次饲料试验，第一次饲料试验体重增长率最高，当水温降低到24 ℃以下时，0#、3#、4#各组在试验后期体重增重率还出现负增长，并且各组在试验期间体重增长率有一定差异，试验1#、2#组日本医蛭增重率高于其余组，分别为102.33%±12.12% 和114.33%±14.81%，显著高于3#组（P<0.05）。由表7可知，各组在试验期间日本医蛭饲料系数有一定差异， 1#、2#组饲料系数分别为3.57±0.31和3.41±0.25，低于其余各组，并显著低于0#、4#组（P<0.05）。由表8可知，各组在试验期间日本医蛭存活率有一定差异，试验1#、2#组日本医蛭在存活率显著高于其余3组（P<0.05），分别为88.00%±5.64%和87.00%±4.23%。

2.3 两种基础饲料配比不同浓度的嗜水气单胞菌其日本医蛭各项评价指标的相互比较

由表9可知，以新鲜猪血为基础饲料各试验组日本医蛭总增重率显著高于人工饲料为基础饲料各试验组日本医蛭总增重率（P<0.05）。由表10可知，以人工饲料为基础饲料各试验组饲料系数高于以新鲜猪血为基础饲料各试验组饲料系数。其中，0#、3#、4#组以人工饲料为基础饲料各试验组饲料系数显著高于以新鲜猪血为基础饲料各试验组饲料系数（P<0.05）。由表11可知，除1#组外，以新鲜猪血为基础饲料各试验组总存活率高于以人工饲料为基础饲料各试验组。其中，以新鲜猪血为基础饲料3#组的总存活率显著高于以人工饲料为基础饲料3#组的总存活率（P<0.05）。

3 讨论

日本医蛭生活于水田、池塘和水沟里，以人、畜的血液为食，具有特殊的摄食性。如何能够在养殖生产过程中提高日本医蛭的产量，并降低其死亡比例是急需解决的问题。目前，为解决水产养殖面临的水体富营养化、农药残留、病原微生物抗耐药性问题，提高水产经济动物成活率和产量，微生态制剂已被广泛应用于水产业中。有资料报道，芽孢杆菌能提高鲤鱼、异育银鲫和凡纳滨对虾等水产动物的蛋白酶活性[10-12]，提高大菱鲆和斑节对虾的增重率和成活率[13，14]。然而，微生态制剂用于日本医蛭养殖生产尚未见到有关报道。笔者曾在前期实验中从日本医蛭肠道中分离出优势工程菌嗜水气单胞菌，Sivachdran等[15]报道了水蛭肠道工程菌能够促进血细胞的吸收，所以本试验通过在日本医蛭饲料中配比不同浓度的嗜水气单胞菌，从而找到能够提高日本医蛭产量和降低日本医蛭死亡率的最佳配比浓度。

两种基础饲料配比不同浓度的嗜水气单胞菌试验中，第一次饲料试验日本医蛭增重率都不同程度高于后期饲料试验日本医蛭增重率，说明日本医蛭在饥饿状态下的摄食量要高于正常养殖状态下日本医蛭的摄食量。在以人工配合饲料为基础饲料配比试验中，0#、3#、4#各组在试验后期体重增长率出现负增长，而以新鲜猪血為基础饲料配比试验却未出现此状况，这说明在相同的养殖环境和水温条件下，当水温降到24 ℃以下时，以人工配合饲料为基础饲料对日本医蛭的摄食状况影响很大，出现其摄食量小于代谢量，从而出现负增长。

从表3-表8的试验结果分析表明，两种基础饲料配比试验中，与对照0组比较，饲料中适当添加嗜水气单胞菌，日本医蛭的增重率和成活率都有所提高，而饲料系数有所降低，这可能是因为以下几点原因：①嗜水气单胞菌能够调节日本医蛭消化道的内环境，恢复和维持正常微生物的平衡，从而抑制了大肠杆菌、沙门氏菌等条件致病菌的增殖，使得消化机能正常运行而不紊乱。②日本医蛭肠道中繁殖的嗜水气单胞菌能在代谢过程中能合成多种维生素和氨基酸，从而增加营养物质供给宿主利用，有明显的加强代谢的作用。③嗜水气单胞菌可能刺激日本医蛭免疫系统的建立，增强了其防病、抗病能力。④嗜水气单胞菌能分解蛋白质、脂肪，促进对血细胞的吸收，促进了医蛭对营养物质消化吸收。

从表9-表11的试验结果分析，综合比较两种基础饲料配比试验中的各试验组总增重率、饲料系数和存活率的综合指标可看出，以新鲜猪血为基础饲料各试验具有总增率高、饲料系数低和存活率较高等特点，这可能与日本医蛭摄食习性有关。自然生态条件下，日本医蛭以哺乳动物的血液为食，哺乳动物的新鲜血液主要含有血浆和有形成分两部分，其中有形成分包括红细胞、白细胞和血小板；血浆主要成分有血浆蛋白、非蛋白质的有机物和无机盐；而人工饲料所用血球蛋白粉是新鲜血液在低温处理条件下，经去除血浆、浓缩的血球经高温瞬间喷雾干燥后得到的粉末，再添加复合维生素预混合饲料、氯化钠和精氨酸，以满足饲料对日本蛭的诱食性及其营养需求；人工饲料虽然保留了高品质的营养成分，但血球蛋白粉与血细胞的形态有显著差异，这可能就影响了日本医蛭肠道工程菌对人工饲料吸收作用，从而最终表现出两种基础饲料配比试验中的各试验组总增重率、饲料系数和存活率一定的差异。

總之，日本医蛭在人工养殖过程中，适当加入一定量的嗜水气单胞菌可以提高日本医蛭产量，在一定密度下降低其死亡率，本文的研究为日本医蛭大规模养殖生产提供了一定的科学数据。

参考文献：

[1] 杨潼.中国动物志.环节动物们.蛭纲[M].北京 科学出版社，1996：110.

[2] 张彬.菲牛蛭（Hirudinaria manillensis Lesson，1842）养殖生态学、生化成分及其抗凝活性研究[D].广州：中山大学，2008.

[3] 周易勇，杨潼.医蛭唾液腺分泌物：成分、功能及应用前景[J].天然产物研究与开发，1991，3（4）：54-57.

[4] Scacheri E，Nitti G，Vaslasina B，et al.Novel hirudin variants from the leech Hirudinaria manillensis.Amino acid sequence，cDNA cloning and genomic organization[J].Eur J Biochem，1993，214（1）：295-304

[5] Vindigni A，De Filippis V，Zanotti G，et al.Probing the structure of hirudin from Hirudinaria manillensis by limited proteolysis.Isolation，characterization and thrombin–inhibitory properties of N-ter minal fragments[J].Eur J Biochem，1995，226（2）：323-333

[6] Kim D，Horbett T A，Takeno M M，et al.Pharmacology and Controlled Release of Hirudin for Cardiovcascular Disorders[J].Elsevier Science inc，1996，5：337-349

[7] 宋大祥，冯钟琪.蚂蟥[M].北京 科学出版社，1978：23

[8] 丁鲁民.吸血蛭类采集、保存及制片方法[J].口岸卫生控制，2004，9（4）：14-15

[9] Hokelek M，Guneren E，Eroglu C.An experimental study to sterilize medicinal leeches[J].Eur J Plast Surg，2005，25：81-85

[10] 潘康成，何明清，刘克琳.微生物添加剂对鲤鱼生长和消化酶活性的影响研究[J].饲料工业，1997，18（10）：41-42

[11] 刘小刚，周洪琪，华雪铭，等. 微生态制剂对异育银卿消化酶活性的影响[J].水产学报，2002，26（5）：448-453

[12] 丁贤，李卓佳，陈永青，等.芽孢杆菌对凡纳对虾生长和消化酶活性的影响[J].中国水产科学，2004，11（6）：580-584

[13] Gatesoupe F J.The effect of three strains of lactic bacteria on the production rate of rotifers， Brachionus plicatilis， and their dietary value for larval turbot，Scophthalmus maxmus[J]. Aquaculture，1991，96（3-4）：335-342.

[14] Rengpipat S， Phianphak W，Pjyatiratitivomkul S，et al.Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp（Penaeus monodon）survival and growth[J].Aquaculture，1998，167（3）：301-313

[15] Sivachandran P，Marimuthu k，Ravichandran M，et al.Antibiotic susceptibility of body surface and gut micro flora of two aquatic leech species（Hirudinaria manillensis and Hirudinaria javanica） in Malaysia[J].Journal of Coastal Life Medicine，2013，1（1）：76-80