高效液相色谱法测定多组分样品的实验教学探讨

刘 普，邓瑞雪，高嘉屿，孙鲜明，尹卫平

（河南科技大学 化工与制药学院，河南 洛阳 471023）

·实验教学·

高效液相色谱法测定多组分样品的实验教学探讨

刘 普，邓瑞雪，高嘉屿，孙鲜明，尹卫平

（河南科技大学 化工与制药学院，河南 洛阳 471023）

高效液相色谱法是天然有机化合物定性定量分析测试的重要手段。该文探讨建立一种采用RP－HPLC同时测定丹皮中几种单萜苷类化合物含量的方法。研究确定了HPLC法分离和测定的色谱条件，包括色谱柱、流动相、流速、检测波长等。该实验为课题组实际研究过程中多组分样品的分析，实验过程中采用流动相梯度洗脱和测试波长变换测试的方法，实验方案的设计涵盖了高效液相色谱法测试中的主要知识点。实践表明，通过实验提高了学生的学习兴趣，锻炼了动手能力。

高效液相色谱；实验教学；波长变换；外标法

高效液相色谱法（high performance liquid chro matography，HPLC）是现代研究中一种重要的分离分析手段。高效液相色谱是有机化合物快速高效分离分析的重要手段，具有其他方法所不具备的优点［1－5］。目前，高效液相色谱已在食品检验、中药质量控制、环境监测、生物工业、制药工业等科学领域得到广泛应用，成为现代自然科学研究中必不可少的常规仪器［6－7］。作为一种常见的分析测试手段，高效液相色谱法是仪器分析课程和现代分析测试技术课程中一个非常重要的教学内容，掌握高效液相色谱的仪器工作原理及基本操作方法是很多专业学生必须掌握的基本技能［8－9］。

高效液相色谱法测定多组分样品实验为我校化学工程与工艺专业、有机化学专业和药理学专业研究生课程现代分析测试技术中的一个综合设计性实验。该实验的主要目的是训练学生进一步掌握高效液相色谱基本工作原理及操作方法，掌握采用梯度洗脱、波长变换及外标法测定多组分有机化合物含量的方法。我校的研究生在本科阶段时已经学习了分析化学、仪器分析和天然产物化工等课程，对采用HPLC测试单组分天然产物样品的方法已经有了掌握。

由于科研工作的需要，作者所在的研究团队对一些天然植物进行了化学成分的研究，并探索了采用HPLC测试多组分化合物的方法，并将其整理为研究生现代分析测试技术综合设计性实验［10－12］。本实验拟在本科阶段分析化学和仪器分析课程实验的基础上，借助研究生的现代分析测试技术课程和学院分析测试中心实验教学平台，在前期科研积累的基础上，设计了采用高效液相色谱测试多组分样品的综合设计性实验，指导学生进一步掌握复杂样品的处理方法、波长变换、梯度洗脱及采用外标法计算多组分含量等方法。

1 实验内容

1.1 实验目的

熟练掌握利用高效液相色谱仪的波长变换和梯度洗脱的方法来进行定性和定量分析的原理及方法；熟悉外标法测试多组分样品含量的原理及方法。

1.2 高效液相色谱原理

高效液相色谱分析原理是基于待测组分在固定相和流动相中的吸附能力、分配系数或其他亲和作用的差异进行分离，进而进行定性和定量分析测定。高效液相色谱仪器主要由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统等组成［1］。

外标法是以待测成分的标准对照品作为对照物质，相对比较以求得供试品中相对应化合物含量的方法。外标法首先用待测组分的标准样品通过高效液相色谱分析，测出已知不同含量的标样系列中各峰所对应的峰高或峰面积，然后根据响应信号与含量之间的关系，绘制出标准曲线。定量分析样品时，在与标准曲线相同条件下进同等样量的待测样品，从高效液相色谱图上测出峰高或峰面积，再从标准曲线查出待分析组分所对应的浓度，进而根据待测样品的质量和浓度计算待测组分的含量［1－5］。

1.3 仪器和试剂

Agilent1100高效液相色谱仪（配备：四元泵、二极管阵列检测器（G1313A）、在线脱气机、柱温箱、自动进样器和Agilent1100色谱工作站）：安捷伦科技公司；FA2004型电子分析天平：上海越平科学仪器有限公司；UV－2600紫外光谱仪：岛津仪器（苏州）有限公司。

4″－羟基白芍苷、氧化芍药苷、白芍苷、芍药苷、paeonidanin和白芍苷R1等标准品由河南科技大学天然产物研究室自制，每个对照品的结构均经NMR和ESI－MS波谱数据对比鉴定，化合物的纯度经HPLC测定均大于98。丹皮购置于洛阳宝神鹿大药房有限公司九都路店。

配置流动相所用的乙腈和磷酸二氢钾均为色谱纯，水为实验室自制的高纯水，其他研究所用到的有机试剂均为分析纯。

1.4 实验步骤

1.4.1 对照品溶液的制备

用分析天平分别精密称取一定质量的对照品，加适量甲醇溶解，转移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容。所称取的对照品的质量及配置的标准溶液浓度如表1所示。

表1 6种单萜苷对照品的质量及在配置对照品浓度

1.4.2 吸收波长的选择

称取一定量的各个对照品，用甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中。采用可见紫外可见光谱仪对制备的各个对照品在200～400 nm进行全波长扫描，用甲醇作空白对照，记录各个化合物的最大吸收波长。

1.4.3 流动相的选择

分析文献［13－15］报道发现在分离分析芍药苷等单萜苷类化合物所采用的一般为乙腈的磷酸水流动相体系。本实验根据参考文献并进行初步尝试的基础上也选择乙腈－水流动相体系来分析，并对流动相体系进行了优化。在研究中发现，仅仅乙腈－磷酸水体系难以实现对4″－羟基白芍苷和氧化芍药苷两种单萜苷的分离。在课题组前期糖苷类分离分析方法［16］的基础上，在乙腈－水流动相体系中引入了磷酸二氢钾缓冲盐，并对该分离流动相体系进行了优化，最终选择了pH＝3.0的磷酸二氢钾缓冲盐与乙腈混合作为本研究的流动相体系。

1.4.4 供试品溶液的制备

将购买的待测样品丹皮放置在温度为100℃干燥箱中干燥3小时。将烘干后的丹皮置于干燥器中冷却至室温，用高速粉碎机粉碎，过60目筛，备用。

精密称取丹皮样品3份，每份10.00 g。将样品分别用滤纸包好，置于索氏提取器中，各加入100 mL溶剂，回流提取4小时。回收各提取液，冷却，用0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液定容于100 mL容量瓶中，即得供试品溶液。

在实验实施过程中，提供学生选择的甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等作为提取溶剂。选择的提取方法有：索氏提取器、超声提取器、回流提取和冷浸提取等多种不同的提取方式。在实验过程中学生可以自由选择提取溶剂和方法。

1.4.5 线性关系的考查

精密吸取步骤（1）中配置混合对照品溶液1 mL加入到10mL容量瓶中，用甲醇定容。然后精密吸取0.75、1.5、3、6、12μL混合对照品注入高效液相色谱仪，按照实验优化的色谱条件进行测定，记录保留时间和峰面积。以每一个对照品的进样量x为横坐标，色谱峰的峰面积y为纵坐标进行线性回归，绘制每个对照品的标准曲线。

2 实验结果

2.1 色谱条件

2.1.1 吸收波长

采用紫外可见光谱仪在波长200～400 nm间进行全波长扫描，以确定各个单萜苷的最大吸收波长，从而确定合适的检测器检测波长。在对各个单萜苷类化合物对照品进行全波长扫描中发现，4″－羟基白芍苷和氧化芍药苷两个单萜苷在260 nm波长处有最大吸收，而单萜苷白芍苷、芍药苷、Paeonidanin、白芍苷R1等在232 nm波长处有最大吸收。所以在测定4″－羟基白芍苷和氧化芍药苷两个单萜苷时选择260 nm波长，在测试白芍苷、芍药苷、Paeonidanin、白芍苷R1等4个单萜苷时选择232 nm的测定波长。所以本实验采用变波长的测定方法，根据在实验中确定的各个单萜苷类化合物的保留时间，本实验在0～7.5 min时间段内的检测波长为260 nm，在7.5～22 min时间段内的检测波长为232 nm。

2.1.2 流动相

在实验过程中对单萜苷类化合物的分离流动相体系进行了优化，最终选择pH＝3.0磷酸二氢钾缓冲盐－乙腈体系为本实验的流动相体系。流动相的洗脱条件为：采用梯度洗脱，梯度为0 min（乙腈，15）→10 min（乙腈，15）→22 min（乙腈，25）。在优化的条件下，每个单萜苷类化合物都得到很好的分离，并且缩短了分析时间（22 min），节约了流动相的用量。

2.1.3 色谱条件

通过一系列的优化实验，得到分析丹皮中单萜苷类化合物的色谱条件为：Agilent1100高效液相色谱仪；Zorbax SB－Aq C18色谱柱（4.6×250 mm，5μm）色谱柱；乙腈－磷酸二氢钾缓冲盐（pH＝3.0）为分析流动相体系；流动相洗脱梯度为：0 min（乙腈，15）→10 min（乙腈15）→22 min（乙腈，25）；检测波长为：（0～7.5 min）260 nm，（7.5～22 min）232 nm；体积流量为1.0 mL·min－1；柱温为30℃；进样量为10μL。

2.2 色谱图

取混合对照品溶液和供试样品溶液稀释到适当浓度进行HPLC分析，对照品色谱图（A）和供试品色谱图（B）如图1所示。测试结果表明，当流动相为乙腈－磷酸二氢钾缓冲盐（pH＝3.0），洗脱梯度为0 min（A，15）→10 min（A，15）→22 min（A，25），流速为1.0 mL／min时，6种单萜苷类化合物对照品的分离效果较好。从峰形可以看出，得到的峰形尖锐、对称，无前伸或拖尾现象，基线平稳，属于大信噪比的窄峰，这样的峰形有利于保证定性、定量的准确性和重现性。从保留时间看，所有样品在20分钟内均实现较好的分离，6种单萜苷的保留时间分别为：4″－羟基白芍苷5.289 min，氧化芍药苷5.637 min，白芍苷8.699 min，芍药苷9.766 min，Paeonidanin17.794 min，白芍苷R1为19.113 min，分析时间短，有利于样品的快速检测。从分离度上看，所有的样品均实现了很好的分离。供试品和对照品色谱图比较可以看出，供试品色谱图中具有和对照品保留时间一致的色谱峰，虽然由于供试品成分复杂，其中含有多个色谱峰，但从图1中可以看出其他成分色谱峰与待测成分之间分离效果良好，待测成分没有明显地受到其他样品峰的干扰。说明该条件可以实现对6种单萜苷类化合物的分析。在采用HPLC分析测试样品时，待测组分之间的良好分离度、峰形和较短的保留时间，以及其他成分对待测组分的干扰都是必须要考虑的问题，这些问题也决定了流动相，洗脱梯度和洗脱流速等色谱条件的选择。

2.3 标准曲线绘制

精密吸取混合对照品溶液1mL，加入到10mL容量瓶中，加入甲醇定容。然后用自动进样器吸取0.75、1.5、3、6、12μL对照品溶液注入高效液相色谱仪，按照2.1.3节的色谱条件进行分析，记录保留时间和峰面积。以样品的进样量x为横坐标，以每个标准对照品的峰面积y为纵坐标进行线性回归，得到6种单萜苷类化合物的线性回归方程（如表2所示）。4″－羟基白芍苷、氧化芍药苷、白芍苷、芍药苷、Paeonidanin和白芍苷R1等6个单萜苷样品线性回归方程的R值在0.999 64～1.000 00之间，表明试验数据与拟合函数之间的吻合程度非常好，6个单萜苷样品在各自的线性范围内显示了很好的线性关系。说明在该范围内可以准确地测定这6种单萜苷类化合物的含量。

图1 对照品（A）和样品的色谱图（B）

表2 6种单萜苷对照品的线性关系

2.4 方法学考查

2.4.1 精密度试验

按上述优化的色谱条件，将对照品混合物溶液连续进样6次，记录每次的峰面积，分别计算6种单萜苷类化合物4″－羟基白芍苷、氧化芍药苷、白芍苷、芍药苷、Paeonidanin和白芍苷R1等峰面积的RSD值。测试结果表明峰面积的RSD值均小于1，表明实验精密度良好。

2.4.2 稳定性试验

取供试品溶液，配制后分别放置0、2、4、8、12、24、48 h后进样，记录每次进样测定的峰面积。研究结果发现4″－羟基白芍苷、氧化芍药苷、白芍苷、芍药苷、Paeonidanin和白芍苷R1等6个单萜苷类化合物峰面积的RSD值均小于1.5，表明本实验测试的供试品溶液在48 h内具有较好的稳定性。

2.4.3 重复性试验

精密称取丹皮粉末5份，每份10 g，按照1.4.4节方法操作，制备所需供试品溶液，测定4″－羟基白芍苷、氧化芍药苷、白芍苷、芍药苷、Paeonidanin和白芍苷R1的含量，计算各组分含量平均值分别为0.013，0.32，0.21，1.05，0.000 4，0.008 5；RSD分别为1.05，1.12，1.07，0.87，0.96，1.56。

2.4.4 加样回收率实验

精密称取已经准确测得含量的丹皮样品粉末9份，每份10.00 g，3份为一组，分别精密加入一定量的4″－羟基白芍苷、氧化芍药苷、白芍苷、芍药苷、Paeonidanin和白芍苷R1对照品（加入量约相当于样品中各对照品样品含量的80，100，120），加入10 mL乙醇，按照1.4项下供试品的制备方法操作，制备所需供试品溶液。然后往高效液相色谱中注入10 mL供试品进行分析，根据峰面积测定供试品中6种单萜苷类组分的含量并计算每个单萜苷对照样品的加样回收率。测试结果发现4″－羟基白芍苷、氧化芍药苷、白芍苷、芍药苷、Paeonidanin和白芍苷R1等单萜苷的平均加样回收率在97.1～101.3之间，RSD在0.15～1.3之间。

2.5 丹皮中主要单萜苷类化合物的含量

按上述方法将经过烘干的丹皮高速粉碎机粉碎，过60目筛。按照1.4.4节供试品溶液制备方法进行提取并配置溶液，然后精密吸取供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪中，按照优化的色谱条件分别测定，根据每个对照品的线性回归方程，采用外标法计算丹皮中6种单萜苷类化合物的含量，测试结果如表3所示。

表3 样品含量测定结果／（n＝5，x±s）

表3 样品含量测定结果／（n＝5，x±s）

成分4″－羟基白芍苷芍药R1含量氧化芍药苷白芍苷苷Paeonidanin白芍苷0.013 0.21 0.35 1.05 0.000 4 0.008 5

3 实验效果与讨论

1）该实验是我校化学工艺与技术专业、有机化学专业和药理学专业研究生学位课程现代分析测试技术中开设的综合性设计性实验。通过该实验的实施，使研究生对采用高效液相色谱进行定性和定量分析有了更为深刻的认识和掌握，分析测试的结果可以作为天然产物提取及纯化工艺是否合适的一个判断标准。

2）不同结构类型的化合物的性质不同，在进行提取时选择的提取溶剂及提取方式可能有所不同。在本实验中特意设置了不同的溶剂及不同的提取方法供学生在实验中选择。由老师事先提取并计算出原料丹皮中这几种单萜苷类化合物的含量，然后让同学们比较不同提取方法的收率及主要成分的含量，并计算主要单萜苷类化合物的提取率。实验完成后，可以指导学生通过检索文献资料，分析讨论不同的提取方法和不同的溶剂对单萜苷提取率影响的原因。

3）同样是单萜苷类化合物，不同的结构特点其紫外光谱的最大吸收波长不同。在本实验中4″－羟基白芍苷和氧化芍药苷两个化合物在260 nm波长处吸收最强，白芍苷、芍药苷、Paeonidanin和白芍苷R1等4个单萜苷类化合物在测定波长为232 nm处有最大吸收。指导学生根据紫外测试结果，结合现代分析测试技术课程中的知识分析单萜苷类化合物的结构与紫外光谱最大吸收波长的关系。由于母核结构的微小差异及取代基的不同，在色谱系统中表现出不同的吸附性能，在高效液相色谱上会有不同的保留时间。梯度洗脱是天然产物分析测试中常用的一种洗脱方法。本实验在实施过程中为了节省时间，进行了梯度洗脱，达到了较好的分离效果，使学生认识到采用梯度洗脱，不仅可以获得较好的分析效果，还可以节省实验时间和洗脱溶剂的用量。

4）丹皮为牡丹干燥根皮，秋季采挖根部，除去细根，剥取根皮，晒干。丹皮中含有单萜苷类化合物，如芍药甙等，这些单萜苷主要为芍药苷元及其类似物与葡萄糖缩合而成的化合物，具有非常广泛的生物活性。我们将本实验科研内容引入到研究生高效液相色谱实验教学中，制定了外标法测定丹皮中6种单萜苷类化合物含量的实验项目。该实验HPLC检测过程中，6种单萜苷类成分分离度好，保留时间相对较短。在实验中采用波长变换和梯度洗脱，知识点多，适合于研究生实验教学。通过该实验的学习，学生可以进一步深入掌握HPLC测试的原理和方法。

4 结束语

现代分析仪器和计算机的联用极大提高了仪器的智能化、自动化的程度，工作站的功能越来越强大，高效液相色谱的应用领域愈来愈广泛。对于采用高效液相色谱进行多组分样品的分析测试，选择合适的分析测试条件，建立完整的分析测试方法是一件比较困难的事情，需要经过不断地实验探索来完成［3］。

对于研究生来说，由于接触到的知识比本科生要更多一些，动手能力和自学能力要更强一些。一些相对简单的实验设计已经不能调动学生的学习积极性，需要设计一些更具挑战性的综合设计性实验。本实验由科研成果转化而来，属于教学与科研相结合、理论与应用相结合的综合设计性实验，实验信息量大，涵盖了高效液相色谱法中多个知识点。通过本实验的实施，激发了学生的学习兴趣，提高了学生的动手能力、分析问题和解决问题的能力。

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Experimental Teaching of HPLC w ith UV Sw itch Simultaneous Determ ination of M ulticom ponent Contents

LIU Pu，DENG Ruixue，GAO Jiayu，SUN Xianming，YINWeiping
（Chemical Engineering＆pharmaceutical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，China）

High performance liquid chromatography（HPLC）method is one of the importantmethods for native compounds analy sis.This paper establishes an HPLC method for simultaneous determination of six monoterpene glycosides.Chromatographic condition was optimized，which included column，mobile phase，flow rate，detection wavelength.The experiment is amulticomponent analysis in the actual research process of the research group.The research process includes the gradient elusion and the various wavelength test.The design of the experimental scheme covers the main knowledge points of high performance liquid chromatographic test.The practice shows the students interest in learning and the ability of practicing are all improved through the experiment.

HPLC；experimental teaching；wavelength conversion；external standard method

O 657.7＋2；G 642.423

A

10.3969／j．issn．1672－4550.2017.03.011

2015－09－13；修改日期：2017－04－17

河南科技大学研究生精品课程建设项目（2015YJG－025）；河南省教育技术装备和实践教育研究立项课题（GZS357）；河南省化学工程与工艺特色专业建设项目（201015218）。

刘普（1978－），男，博士，副教授，主要从事天然产物分离分析的研究教学工作。

邓瑞雪（1978－），副教授，dengliu20022002＠163.com