某规模化牛场口蹄疫免疫抗体水平检测及分析

程凯慧++宋玲玲++朱彤++王洪梅++苗自利++张亮++谷祖烨++杨宏军++何洪彬

摘要：为了解某规模化牛场口蹄疫病毒（FMDV）的抗体水平及疫苗的免疫效果，本研究应用液相阻断ELISA检测技术对2012—2015年出生牛的380份血清进行A型FMDV和O 型FMDV的抗体水平检测。结果表明，该牛场A型FMDV和O型FMDV的抗体阳性率分别为74.7%、85.5%，整体免疫水平偏低。

关键词：A型口蹄疫；O型口蹄疫；抗体水平；免疫程序

中图分类号：S823+S852.5+2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）06-0123-03

AbstractIn order to know the antibody level to Foot-and-mouth disease virus （FMDV） and the immune effect of vaccine in a large-scale cattle farm， the antibody levels of 380 samples of serum from cattle born in 2012—2015 to FMDV type A and FMDV type O were detected using liquid-phase blocking ELISA kit. The results showed that the antibody positive rate to FMDV type A and type O was 74.7% and 85.5% respectively， so the immune antibody level was low in the cattle farm.

KeywordsFoot -and- mouth disease type A； Foot- and -mouth disease type O； Antibody level； Immunization schedule

口蹄疫 （Foot-and-mouth disease， FMD） 是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus， FMDV）引起的多种偶蹄动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病[1-3]，被OIE列为A类疫病，我国列为一类动物疫病[4]。我国口蹄疫疫情处于多发、散发、地方性流行状态，由于口蹄疫病毒血清型多、变异快，病原污染严重，毒株复杂，牛羊等畜种均可带毒[5]。一旦暴发口蹄疫，所有感染和接触的动物都必须宰杀并销毁尸体，严重制约畜牧业的持续健康发展。

目前，对易感动物进行强制性疫苗免疫是防控口蹄疫病毒流行最有效的措施，液相阻断ELISA是使用较为广泛的口蹄疫诊断手段[6，7]。ELISA检测方法即使用口蹄疫灭活病毒作为抗原来检测口蹄疫病毒血清样品，主要用于检测免疫动物血清内抗体的分泌水平，以了解动物的免疫状态和抗病能力。该法具有快速、灵敏、准确等优点，适合大批样品的血清学调查，是国际认可的一种标准化诊断方法。为了解牛口蹄疫O型、A型、AsiaⅠ型三價灭活疫苗的免疫效果及某规模化牛场的整体免疫水平，笔者对该牛场牛群按照牛出生时间合理搭配，抽取380头牛只进行采血，进行口蹄疫抗体水平检测，以期为该牛场进一步制定合理的免疫程序提供参考。

1材料与方法

1.1血清样品

采集某规模化牛场均已成年的2012—2015年出生的荷斯坦奶牛血液共380份，采血后自然凝固，分离血清，置4℃冰箱保存备用。

1.2牛场免疫程序

牛口蹄疫 O型、A型、AsiaⅠ型三价灭活疫苗，购自金宇保灵生物药品有限公司，接种途径和免疫剂量严格按照疫苗使用说明书操作。由于母源抗体水平过高可能会干扰疫苗免疫效果，因此犊牛在母源抗体水平不高的情况下进行免疫。免疫程序为犊牛90日龄首免口蹄疫三价灭活疫苗，首免后1个月进行二免，以后每4个月加强免疫1次；成年母牛首免后每4个月加强免疫1次。

1.3诊断试剂盒

本试验A型/O型FMDV诊断试剂盒为兰州兽医研究所口蹄疫病毒液相阻断ELISA试剂盒。

1.4检测方法与结果判定

1.4.1检测方法严格按照试剂盒说明书进行抗体水平检测。①稀释血清。根据需要将血清在U型反应板上进行稀释，以50 μL/孔的量用1×PBST 2倍连续稀释血清。在第1～10列稀释被检血清，从1∶8稀释至1∶64；在第11列稀释阳性血清，从1∶8稀释到1∶1 024；A12～B12孔稀释阴性血清，从1∶2稀释到1∶4；E12～H12为病毒抗原对照孔。

②加入病毒抗原。将病毒抗原用1×PBST稀释至工作浓度，以50 μL/孔的量加入到被检血清、阴性对照血清、阳性对照血清的每一稀释孔内，4孔病毒抗原对照孔仅加入100 μL/孔稀释至工作浓度的病毒抗原。加入等量的病毒抗原后，血清的稀释度加倍，被检血清从1∶16～1∶128，阳性血清由1∶32～1∶4 096。封板，振荡，4℃静置过夜。

③将抗原抗体混合液从U型反应板上按次序转移至已包被口蹄疫A型/O型兔抗的ELISA板上，50 μL /孔，封板，37℃温育60 min。

④ 洗板3～5次，甩干，按50 μL/孔加口蹄疫A型/O型豚鼠抗体工作液，封板，37℃温育30 min。

⑤洗板3～5次，甩干，按50 μL/孔加兔抗豚鼠IgG-HRP 工作液，封板，37℃温育30 min。

⑥洗板3～5次，加50 μL/孔底物溶液（底物溶液务必加H2O2），每毫升加10 μL本试剂盒配备的3%H2O2，37℃温育15 min，每孔再加50 μL终止液终止反应，读取OD492nm。

1.4.2结果判定①认可标准。每孔板4孔病毒抗原对照OD492nm在1～2的范围内，阳性抗体效价应在1∶（2～4）之间，阴性对照血清抗体效价应<1∶8。

②血清抗体效价判定。4孔病毒抗原对照弃去最高值和最低值，计算剩余2孔的平均值，再除以2，为50%对照值，即为临界值。被检血清OD492nm大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔。

③结果判定。抗体效价大于或等于1∶128判为抗体A型/O型阳性；1∶64～1∶128时，判为可疑；小于1∶64，判为阴性。可疑样品，要重新检测，重测抗体效价大于或等于1∶128判为抗体A型/O型阳性，小于1∶128判为阴性。

④ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护的关系。抗体效价≥1∶128，99%以上保护；效价≤1∶16，不保护；在1∶22～1∶90之间，50%保护。

2结果与分析

调查结果（表1）显示，该规模化牛场A型FMDV抗体效价≥1∶128（阳性率）有284份，抗体效价在1∶22～1∶90之间（可疑率）的有0份，抗体效价≤1∶16（阴性率）有96份，该牛场A型FMDV保护率（阳性率）为74.7%；O型FMDV抗〖CM（21〗体效价≥1∶128（阳性率）有325份，抗体效价在1∶22～1∶90之间（可疑率）的有0份，抗体效价≤1∶16（阴性率）有55份，该牛场O型FMDV保护率（阳性率）为85.5%。

3讨论与结论

随着畜牧养殖业的不断发展，我国养牛业的规模越来越大，同时不同牛场或牛群间流动频繁，养殖场自身不能及时做好有效检疫，甚至不少养殖户还没有意识到免疫检测对全场牛群的免疫防控的重要性，加重了牛传染病的流行，给养牛业带来一些不必要的经济损失，影响了养牛业的发展。

当前我国针对口蹄疫主要采取疫苗免疫为主，配合以扑杀、流行病学监测、流通检测、进口检疫以及生物安全控制的综合防控措施[8，9]，疫苗的免疫效果成为有效预防疫病的关键，《农业部2006年高致病型禽流感和口蹄疫方案（草案）》规定的群体免疫保护率必须在70%以上，该规模化牛场的口蹄疫抗体免疫水平符合国家规定的保护率，但整体免疫水平不是很高，尤其是A型口蹄疫的抗体水平刚达到国家规定的保护率。笔者对该牛场进行了走访，分析原因主要有以下几个方面：第一，口蹄疫灭活疫苗的推荐免疫程序为每4个月免疫一次，能保障抗体水平>1∶96，而该牛场已有9个月未进行疫苗免疫，间隔时间太长，导致抗体水平下降；第二，我国口蹄疫疫情呈散发、多发和周期性爆发状态。2013年我国个别牛场爆发了A型口蹄疫，严重危害了牛、羊、猪等养殖业的发展[10]。由于流行株的变异和国外病毒株的传入，现有A型口蹄疫疫苗（种毒AF/72和A/WH/09）对2013年A型FMD大流行的防控不理想。

针对该牛场的这一现状，建议牛场立刻进行口蹄疫疫苗免疫，并展开牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等其他抗体水平的检测，及时进行疫苗免疫，以避免病原的流行及经济损失。

参考文献：

[1]Pyakural S， Singh U， Singh N B， et al. An outbreak of foot-and-mouth disease in Indian elephants （Elephas maximas）[J]. Veterinary Record， 1976，99（2）：28-29.

[2]Verma N D，Sarma D K. Note on foot-and-mouth disease in mithun in Arunachal Pradesh[J]. Indian Journal of Virology，1997，13（1）：75-76.

[3]Vosloo W， Boshoff K， Dwarka R， et al. The possible role that buffalo played in the recent outbreaks of foot-and-mouth disease in South Africa[J]. Annals of the New York Academy of Sciences， 2002， 969：187-190.

[4]Knipe D M， Howley P. Fields Virology[M].5th Edition.2006.

[5]白丽鸽.口蹄疫分子流行病学的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医， 2011（8）： 49-51.

[6]何启盖，陈焕春，吴斌，等.规模化猪场猪瘟、细小病毒、口蹄疫抗体水平监测和免疫效果分析[J].中国预防兽医学报，2000， 22（1）：5-9.

[7]郭會玲.牛口蹄疫感染抗体血清学调查及口蹄疫三价灭活疫苗免疫效果评价[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2013.

[8]郑海学， 何继军， 郭建宏，等. 口蹄疫及其防控技术[J].兽医导刊，2012（12）：35-41.

[9]苗海生，李华春，李乐，等.口蹄疫的诊断及防控技术概述[J].湖北畜牧兽医，2007（4）： 23-25.

[10]岳瑞超，程子龙，李宁，等.山东牛场常见传染病血清流行病学调查[J].中国动物检疫，2014，31（6）：58-61.