鸭星状病毒单克隆抗体的制备及鉴定

杨彬彬，王雨舟，郭 辉，张 冰，张大丙

(1. 中国农业大学动物医学院，北京海淀100193 ； 2. 南开大学生命科学学院，天津南开300071)

鸭星状病毒单克隆抗体的制备及鉴定

杨彬彬1，王雨舟2，郭 辉1，张 冰1，张大丙1

(1. 中国农业大学动物医学院，北京海淀100193 ； 2. 南开大学生命科学学院，天津南开300071)

为了制备针对鸭星状病毒(Duckastrovirus, DAstV)衣壳蛋白的单克隆抗体，以DAstV C-NGB株为免疫原，用ORF2重组蛋白作为抗原进行筛选，获得7株稳定分泌抗DAstV ORF2蛋白单抗的杂交瘤细胞。取E5C1株和C10F6株进行鉴定，结果表明，2株单抗均为IgM，轻链均为κ型；细胞上清和小鼠腹水的效价分别为105和106以上；免疫印迹试验表明，2株单抗均能识别重组ORF2蛋白；特异性试验表明，E5C1株杂交瘤细胞的培养上清只与DAstV反应。

鸭星状病毒 ； 单克隆抗体 ； ORF2蛋白

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis, DVH)是危害养鸭业的高度致死性传染病，其病原包括小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲肝病毒和星状病毒科禽星状病毒属的鸭星状病毒(Duckastrovirus, DAstV)。其中，DAstV指历史上所称的鸭肝炎病毒血清2型和3型[1-7]。一般认为，仅英国和美国发生过DAstV感染引起的DVH[1-7]，而付余(2008)的研究结果表明，我国江苏已出现由DAstV引起的DVH[8]。对基因组部分序列进行比较的结果表明，我国的DAstV毒株(C-NGB株)可能属于鸭肝炎病毒血清2型[8]。迄今为止，DAstV的检测方法仍十分缺乏。通常认为电镜技术是诊断DAstV感染最可靠的诊断方法，但该法不适用于大量样品的检测。为建立快速的检测方法，本研究以DAstV C-NGB株为材料，制备了针对衣壳蛋白的单克隆抗体。

1 材料与方法

1.1 毒株、细胞及实验动物 DAstV C-NGB株、鸭甲肝病毒、鸭瘟病毒均由本实验室保存，番鸭细小病毒、禽副黏病毒1型均由扬州大学兽医学院王永坤教授惠赠，SP2/0细胞株由中国农业大学实验动物所病毒室张国中教授惠赠；8周龄雌性BALB/c小鼠，购自军事医学科学院实验动物中心。

1.2 主要试剂 纯化的DAstV ORF2重组蛋白由本室制备并保存。HAT、HT选择培养基，购自Sigma公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、二甲基亚砜，购自GIBCO BRL公司；Clonotyping System(5300-05)，购自Southern Biotech公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG、IgM，购自北京博奥森生物技术有限责任公司。

1.3 免疫原的制备 取DAstV C-NGB株病毒液，10 000 r/min (4℃)离心30 min，收集上清，在上清液中缓缓加入氯仿至40%，充分混匀后，置于4 ℃ 1 h，5 000 r/min离心20 min，取水相，10 000 r/min离心30 min，弃沉淀，再以25 000 r/min(4℃)离心3 h，收集上清，沉淀用1%原体积的10 mmol/L PBS缓冲液(pH值7.4)溶解，贮存于-80 ℃备用。

1.4 动物免疫 将抗原和弗氏完全佐剂等量混合，充分乳化，经颈背部皮下多点注射方式免疫8周龄BALB/c小鼠，此后，每隔2周，用加弗氏不完全佐剂的抗原进行加强免疫，共进行3次加强免疫，在进行脾细胞融合前3 d，用抗原液经腹腔再免疫1次。

1.5 间接ELISA检测方法的建立 以ORF2重组蛋白作为包被抗原，首先通过方阵试验确定抗原最佳包被浓度和阴阳性血清稀释度，再按常规程序建立检测抗体的间接ELISA，经酶标仪读取OD450nm，选择P/N值较大且阳性血清OD值在1左右、阴性血清OD值较低的条件为最佳条件。

1.6 杂交瘤细胞株的建立 选择生长状态好的SP2/0骨髓瘤细胞，与免疫鼠脾细胞按照1∶5的比例混合，以50% PEG4000为融合剂按常规方法进行融合。低速离心后，弃上清，用含20%血清和1%HAT的DMEM培养基重悬，加入铺好饲养细胞的96孔板中，100 μL/孔，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每日记录生长情况。每隔2 d换液1次(换液量为50%)，2周后用含1%HT的DMEM培养基培养。待细胞克隆生长到覆盖细胞孔底部1/4～1/3时，用间接ELISA法对上清进行检测，采用有限稀释法对强阳性细胞进行亚克隆。3次亚克隆后对稳定分泌抗体且效价高的杂交瘤细胞株进行扩增培养和冻存。挑选经产BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油，0.5 mL/只。14 d后，经腹腔注射杂交瘤细胞，106个/只。7～10 d后，取腹水，离心收集上清，置-80 ℃保存备用。

1.7 单克隆抗体的鉴定

1.7.1 杂交瘤细胞染色体计数 选择生长状态良好的杂交瘤细胞加入秋水仙素溶液，通过低渗处理、预固定、固定、再固定、制片和染色制备细胞染色体，在显微镜下计算染色体的数目，并照相记录[10]。

1.7.2 亚类及轻链种类的鉴定 按照鼠单抗分型试剂盒介绍的操作步骤进行。

1.7.3 效价的测定 分别将杂交瘤细胞上清和小鼠腹水进行10倍系列稀释，测定其ELISA效价。

1.7.4 免疫印记试验 按常规方法进行SDS-PAGE。以1∶100稀释的小鼠腹水为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠IgM为二抗，进行Western Blot鉴定。

1.7.5 特异性试验 用2 μg/mL ORF2重组蛋白为包被抗原，以HRP标记的山羊抗小鼠IgM为二抗，用间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清与鸭星状病病毒、鸭甲肝病病毒、鸭瘟病毒、番鸭细小病病毒和禽副黏病病毒1型的交叉反应性。

1.7.6 稳定性检测 将杂交瘤细胞分别冻存3个月和6个月，进行复苏培养，用间接ELISA检测上清中的抗体效价。

2 结果

2.1 小鼠免疫抗体的检测 用间接ELISA进行检测的结果显示，经4次免疫后，小鼠血清抗体效价达到1∶8 000以上，在最后一次免疫后3 d，取效价最高的小鼠脾细胞进行融合。

2.2 杂交瘤细胞筛选方法的建立 通过方阵法确定ORF2重组蛋白的最佳包被浓度为2 μg/mL，血清稀释度为1∶800，最佳包被条件为4 ℃过夜，最佳封闭液为1%BSA，阴阳性临界值为0.096。

2.3 杂交瘤细胞株的建立 融合后第3天可见有细胞克隆生长，1周后有杂交瘤细胞生长的孔占80%以上。用间接ELISA筛选出的强阳性细胞经3次亚克隆，得到7株杂交瘤细胞株，分别命名为E5C1、C10F6、A9D10、D3E1、E3G1、F10C7和G3H7。

2.4 单克隆抗体的鉴定

2.4.1 杂交瘤细胞染色体计数 BALB/c小鼠脾细胞染色体数为40条，SP2/0骨髓瘤细胞染色体数为60～70条。用10% Giemsa染液染色后，对E5C1株杂交瘤细胞染色体进行计数，平均值为100条。

2.4.2 亚类及轻链种类的鉴定 用Southern Biotech分型试剂盒鉴定，单克隆抗体E5C1和C10F6株均是IgM亚类，其轻链均为κ型。

2.4.3 效价的测定 用间接ELISA分别对杂交瘤细胞上清和小鼠腹水进行效价测定，2株单抗培养上清的效价为1∶105，腹水的效价为1∶106以上。

2.4.4 免疫印记试验 Western Blotting结果显示，单克隆抗体E5C1和C10F6株能特异性地识别52 kDa的DAstV ORF2重组蛋白(图1)。

2.4.5 特异性试验 E5C1株杂交瘤细胞培养上清与DAstV反应的OD值(1.328)明显高于与鸭甲肝病毒、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、禽副黏病毒反应的OD值(0.081～0.158)。结果说明，E5C1株单抗可特异性识别DAstV。

2.4.6 稳定性检测 将单克隆抗体E5C1株的杂交瘤细胞保存6个月后，经连续传代培养，其上清中的抗体效价仍然大于1∶105。

图1 两株单克隆抗体与ORF2蛋白反应性的鉴定

1：C10F6； 2：E5C1； M：蛋白Marker

3 讨论

迄今为止，DAstV的分离培养较为困难，本试验采用纯化的含毒组织研磨液作为免疫原免疫小鼠，以ORF2重组蛋白作为筛选抗原，既保证了免疫所需的病毒量，又便于筛选出衣壳蛋白的抗体，免疫印记试验结果证实了该结果。

本试验通过细胞融合技术、有限稀释法获得了7株杂交瘤细胞。在ELISA筛选过程中，为了避免菌体自身蛋白和His标签蛋白的干扰，所有筛选的阳性克隆细胞培养上清都已用pET-32a(+)空载体表达产物进行了排除。对单克隆抗体E5C1和C10F6株进行鉴定的结果显示，它们均属IgM亚类，其轻链均为κ型，筛选出IgM型单抗可能与DAstV ORF2蛋白免疫机制有关。本研究结果为下一步研究ORF2蛋白的免疫保护机制奠定了基础，同时为探索新的DAstV快速诊断方法提供一个新思路。

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Preparation andidentification of Monoclonal Antibodies against Duck Astrovirus

YANG Bin-bin1, WANG Yu-zhou2, GUO Hui1, ZHANG Bing1, ZHANG Da-bing1

(1.College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2.College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China)

For preparing monoclonal antibodies (Abs) against duck astrovirus (DAstV) capsid protein, the DAstV C-NGB isolate was used as immunogen and the purified recombinant ORF2 protein as antigen to secreen specific antibodies. Seven hybridoma cell lines that stably secreted Abs against DAstV ORF2 were obtained. Two selected Abs, namely E5C1 and C10F6, were identified as IgM with light chains belonging to κ type. The titers of both Abs in cell culture supernatants and ascites were determined to be 1:105and 1:106， respectively. The reactions of the E5C1 and C10F6 Abs with the recombinant ORF2 protein were confirmed by Western Blotting. The E5C1Ab in culture supernatants was tested to react only with DAstV in specificity tests.

Duck astrovirus; Monoclonal antibody; ORF2 protein

s： ZHANG Da-bing； ZHANG Bing

2014-10-20

公益性行业(农业)专项经费(201003012)；现代农业产业技术体系专项资金(CARS-43)

杨彬彬(1986-)，女，硕士，研究方向为实验动物学，E-mail：binbinyang1986@163.com

张大丙，E-mail：zdb@cau.edu.cn；张冰，E-mail：zhangdb@cau.edu.cn

S852.65+9.6

A

0529-6005(2017)04-0007-02