SD大鼠卵巢氧化应激模型建立

杨雨宇+高正莲+喻诗洋+朱丹+李艺

摘 要：目的：用柠檬酸溶液腹腔注射法制作SD大鼠卵巢氧化应激模型并分析其造模效果。方法 体重相近SD雌性成年大鼠45只，随机分成四组模型组和空白对照组各9只，分别每隔3日用0.30 g/ml、0.60 g/ml、0.90g/ml、1.20g/ml的柠檬酸溶液和生理盐水腹腔注射0.2ml一次，共注射6次。于第6次腹腔注射后第2天，取大鼠卵巢组织，进行大鼠卵巢组织形态学观察、总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测定。结果：模型组卵巢组织切片中可见大量闭锁卵泡，生长卵泡减少。并且随着柠檬酸溶液浓度的升高，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶含量较空白对照组逐渐降低。结论：柠檬酸引起SD大鼠卵巢氧化应激的发生，可以作为卵巢氧化应激的动物模型。

关键词：大鼠；卵巢；氧化应激；柠檬酸

中图分类号：R-332 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）09-0196-02

Abstract：0bjective： The oxidative stress model of SD rat model was made by intraperitoneal injection of citric acid solution to analyze the effect of the model. Methods： Fourty-five adult female SD rats which were similar in weight were randomized equally into four ovarian oxidative stress model groups and a normal control group for intraperitoneal injections of 0.2ml 0.30 g/ml、0.60 g/ml、0.90g/ml、1.20g/ml citric acid solution and normal saline every three days， respectively， infected six times totally. After 6 injections，the rats were sacrificed for histological observation of the ovarian sections and superoxide dismutase（SOD） and glutathione peroxidase（GSH-Px） in the ovary homogenate.Results： Numerous atretic follicles were found in the ovaries of mice in the model group with obviously reduced growing follicle. And with the concentration of citric acid solution increasing， the concentration of SOD and GSH-PX of ovarian oxidative stress model groups in the ovary homogenate is lower than normal control group. Conclusion A rat model of ovarian oxidative stress can be established by intraperitoneal iniecfions of citric acid solution.

Key words：rat；ovary；oxidative stress；citric acid solution

氧化应激（Oxidative Stress）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是破坏了强氧化剂和抗氧化剂的平衡导致的潜在伤害，氧化剂、抗氧化剂平衡的破坏是细胞损伤的主要原因。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。事实上，人体几乎所有的器官都很容易受到氧化应激带来的伤害，症状表现具有多样性，如疲倦、全身无力、肌肉和关节痛、消化不良、焦虑、抑郁、皮肤瘙痒、头痛，以及注意力难以集中和感染难以痊愈等。由氧化应激水平升高诱发的最常见疾病有心脏病、癌症、骨关节炎、风湿性关节炎、糖尿病以及神经退化性问题，如阿尔兹海默癥、帕金森病。其中就卵巢而言，氧化应激不仅影响着卵子的生成、卵泡的发育、卵子的成熟、卵泡的闭锁和排卵等，还能降低卵母细胞和胚胎的质量以及影响早期胚胎的发育能力，这些都会使受精率、胚胎质量、妊娠率显著降低[1]。本课题将进行大鼠卵巢氧化应激模型建立方法的探究，希望能够找到一种经济适用便捷的卵巢氧化应激试剂进行建模，为相关科学领域的研究提供建模方法，增加实验成功的几率，减少资源的浪费，为临床研究相关机制提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 动物

选用西南医科大学实验动物中心提供的健康雌性SD大鼠45只，鼠龄6～7周。

1.2 材料

柠檬酸购自山东省中创柠檬生化有限公司。模型组总超氧化酶歧化酶（T-SOD）测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测试盒、蛋白盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.3 方法

选择健康的、体重相近的雌性SD大鼠45只，随机分为A、B、C、D、E五组，其中A、B、C、D组为模型组，E组为对照组，每组9只，适应性喂养7d。于第8天对A、B、C、D、E五组大鼠分别腹腔注射0.30g/ml、0.60 g/ml、0.90g/ml、1.20g/ml的柠檬酸溶液和生理盐水0.2ml，之后每隔三天按照上述操作注射一次，共注射6次。于第6次注射后第二天用乙醚麻醉后取卵巢组织，进行大鼠卵巢组织形态学观察、总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测定。

1.4 观察指标和方法

（1）一般情况。在实验期间，观察各小鼠饮食、活动情况以精神状况的变化。

（2）组织形态学观察。第6次注射后第2天用乙醚麻醉后，立即解剖，取大鼠左侧卵巢组织，立即置于4%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，4um厚度连续切片，HE染色，光学显微镜下观察各组小鼠卵巢组织学特点及差异。

（3）组织氧化应激标志物检测。第6次注射后第2天用乙醚麻醉后，立即解剖，取大鼠右侧卵巢组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称重，放入匀浆管中。按重量（g）：体积（ml）=1：9的比例加入9倍体积的0.86%的生理盐水于匀浆管中，冰水浴条件下，用眼科小剪尽快剪碎组织块，用内切式匀浆机制备匀浆，10秒/次，间隙30秒，连续5次，制成10%的匀浆液。将制备好的10%匀浆液用普通离心机2000转/分，离心15分钟，取上清液，用总超氧化酶歧化酶（T-SOD）测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测试盒按照试剂盒说明测定卵巢组织匀浆中SOD、GSH-Px的含量。

1.5 统计分析

采用SPSSl7.0软件进行分析，所有数据均以均数±标准差表示，组间均值比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 一般情况

在实验期间，各小鼠饮水、饮食正常，E组均未出现现反应淡漠、异常兴奋、少食少动等异常表现，但A、B、C、D组不同程度地出现了烦躁不安，易怒多动等异常表现。

2.2 组织形态学观察

正常对照组小鼠卵巢形态规整，可见各级发育中卵泡。模型组卵巢皮质变薄，间质过度增生，出现大量原始卵泡，卵泡多呈囊性扩张，内含大量浆液性物质，生长卵泡数目较少，卵泡大量闭锁，极少见黄体出现。

2.3 组织氧化应激标志物检测

用柠檬酸溶液造摸后，引起卵巢组织匀浆中SOD、GSH-Px含量降低，且与正常对照组相比具有明显统计学意义（P≤0.05，表1）。

3 讨论

随着生活节奏和社会竞争的日益加剧，人们的学习工作、日常生活都处于紧张的状态。而这种过度的紧张和焦虑导致了现代女性的心理压力愈来愈大，生殖系统疾病的发病率也相应的增高了不少。其中由氧化应激引起的人类女性生殖系统的疾病比较常见，如受精卵低植入率、低妊娠率、高流产率等[2]。

目前国内对氧化应激模型的研究是当今研究的热点之一，其中对肺、小肠、肝脏、心脏等器官和肠道上皮细胞、心肌细胞、ECFC细胞、黑素细胞、精子等都有了相关的研究。如研究不同浓度葡萄糖氧化酶（GO）对人肝细胞L02氧化应激水平的影响，以确定建立肝细胞氧化应激模型的合适浓度[3]。而针对卵巢的氧化应激研究较少。

本课题组查阅文獻未见有针对大鼠卵巢氧化应激模型的研究，大鼠卵巢氧化应激模型的建立具有如下优点：1）小鼠卵巢较小，取材量极少，不适合多指标研究，而大鼠卵巢较大，适合进行多指标研究；2）大鼠生存能力较强，能较好的耐受造模过程中的种种刺激，比较适合较强刺激性造模。

我们以常见的SD大鼠为研究对象，该鼠种适应性强，体格健壮，对疾病的抵抗力强，实验重复性较好，实验结果易观察和记录，具有代表性，总体费用低，在医学院校的实验室可完成，是复制病理模型较常用的实验动物。

本实验中，抗氧化酶类包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）等，SOD能够将超氧阴离子（O2-·）分解成过氧化氢（H202）和氧分子（O2），中和（O2-·）等自由基，保护组织不受自由基损伤[4]。通过对SD大鼠腹腔注射不同浓度的柠檬酸，检测SD大鼠卵巢组织匀浆中SOD活力，发现模型组SOD活力较对照组降低，且随着柠檬酸浓度的增加，SOD活力逐渐降低。说明模型组SD大鼠卵巢组织受到了氧化损伤，且随着氧化剂浓度的增高，氧化损伤的程度越严重；产生的氧化产物越多，所消耗SD大鼠体内的SOD越多，检测的SOD活力越低。

通过本建模实验可以得出，用柠檬酸建立SD大鼠卵巢氧化应激模型，不仅可以引起卵巢组织形态的变化，还能引起SOD，GSH-PX等相关氧化标记物的变化，而且在一定的氧化剂浓度范围内，随着氧化剂浓度的增高，氧化应激的效果越明显。因此可以推测柠檬酸通过氧化应激机制引起了SD大鼠卵巢组织和功能的变化，造成了氧化损伤，用柠檬酸建立SD大鼠卵巢氧化应激模型的方法可取，可用于实验室造模等。

通过此次实验，我们尝试找到了一种经济适用便捷的卵巢氧化应激试剂进行建模，为相关科学领域的研究提供了一种新的建模方法，该方法可增加实验成功的几率，减少资源的浪费，为临床研究相关机制提供一定的基础。

参考文献

[1]张家庆.小鼠卵巢氧化应激模型建立以及卵巢保护性抗氧化剂的筛选[J].南京农业大学，2013，31（11）：817.

[2]刘怡潼.氧化应激标记物在肥胖不孕女性血清、卵泡液及胚胎培养液中的表达及作用[J].妇产科学，2013，8（6）：414.

[3]赵曙光，李强，王旭霞，刘震雄，闻勤生.葡萄糖氧化酶诱导肝细胞氧化应激模型的建立[J].现代生物医学进展，2011，20（5）：445.

[4]Arosio B，Oagliano N，Fusaro LM，et al.Aloe-Emodin quinone pretreatment reduces acute liver injury induced by Carbon tetrachloride[J].Pharmacol Toxicol，2000，87（5）：229-33.