“滋阴填精”方调控卵巢癌耐药的作用及机理初探

王春梅，薛晓鸥

(北京中医药大学东直门医院妇科，北京 100700)

实 验 研 究

“滋阴填精”方调控卵巢癌耐药的作用及机理初探

王春梅，薛晓鸥*

(北京中医药大学东直门医院妇科，北京 100700)

目的：通过动物实验探讨“滋阴填精”方对卵巢癌耐药的作用并探寻其作用机理。方法：动物模型，分为模型组、顺铂组、中药+顺铂组，中药高、低剂量组。按要求分别进行干预，干预过程中观察动物的一般状态;动物处死后，处理瘤体标本，应用HE染色法检测各组移植瘤的组织结构，观察组织结构的变化，IH法检测各组瘤体LRP、GST-π的表达。结果：与模型组相比，“滋阴填精”方高剂量组、“滋阴填精”顺铂协同作用组均可显著下调LRP的表达，差异具有显著性，P<0.01,P<0.05;“滋阴填精”方与顺铂协同组、“滋阴填精”方高、低剂量组均可明显下调GST-π的表达，与正常组相比，差异显著，P<0.05。结论：“滋阴填精”方可降低卵巢癌对顺铂的耐药性，其机制可能与其降低LRP、GST-π的表达相关。

滋阴填精法；卵巢癌；化疗耐药

卵巢癌的恶性度及癌相关死亡率在妇科恶性肿瘤中一直居于首位[1-3]。因起病隐匿，多数患者直至晚期才能发现。铂类与紫杉醇的联合化疗是一线方案，大部分初治卵巢癌患者对联合化疗十分敏感，但50%～80%的患者在初治18～28个月后复发，并逐渐产生耐药，卵巢癌的5年生存率不到45%。耐药成为影响卵巢癌化疗疗效及患者生存率的主要因素之一[4]。因此，寻求一种增强铂类化疗效果或降低铂类耐药的方法十分必要。

中医学将卵巢癌归于“癥瘕”的范畴。认为其发生与气滞、血瘀、痰湿有关。化疗药为攻伐之品，虽能杀灭肿瘤细胞，但会损伤脾胃，耗精伤血。因多次化疗后，精血损伤与肿瘤耐药同时出现，这种阴精损伤的状态可能与肿瘤耐药密切相关，因此推测“滋阴填精”法可能会调控卵巢癌耐药性。本研究基于“滋阴填精”法，探讨临床验方影响卵巢癌铂类耐药的作用。

1 实验材料

1.1 实验细胞及动物

实验细胞：人卵巢癌耐顺铂株SKOV3-DDP及人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3均购买于中国科学院研究所。实验动物：BALB/C裸鼠25只，雌性，4～6月周龄，体质量18～22 g，购买于SLAC公司，饲养于SPF级清洁动物实验室，实验动物适应环境1周，即开始进行移植瘤实验。

1.2 药品及主要实验试剂

滋阴填精方主要组成部分黄精、麦冬、白芍、白术购买于北京东直门医院中药局；顺铂购买于齐鲁制药厂；RPMI-1640培养液：Gib-co公司；胎牛血清：NQBB公司；免疫组织化学用一抗(GST-pi、LRP)、二抗购买于北京中衫金桥公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养及耐药性的测定

培养方法：SKOV3和SKOV3-DDP细胞均培养于含10%胎牛血清、105U/L青、链霉素的RPMI1640培养液中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，2～3天传代一次。耐药性测定：将胰酶消化的SKOV3-DDP和SKOV3细胞以一定浓度制成单细胞悬液，以每孔103的浓度接种于96孔培养板中，每组设立4个副孔，培养24 h后，每孔依次加入梯度浓度的顺铂液(0、2.5、5、10、20、40、80、160)，再次培养24h后， MTT法检测细胞生存率，计算抑制率，证实SKOV3-DDP细胞的耐药性是否满足实验的需求。

2.2 滋阴填精方的制备

“滋阴填精”方药物组成比例：黄精20 g，麦冬15 g，白芍15 g，生白术15 g，生药浸泡1 h，水煎2次，第1次40 min，第2次25 min，滤纸过滤去渣，22 μm过滤膜灭菌处理后，配成一定生药浓度的母液，储存于-20℃中，待用。

2.3 动物模型的建立及分组、给药

SKOV3-DDP细胞培养、传代，取处于对数生长期的细胞制成单细胞悬液，调整密度至2×107个/mL，混匀后每只裸鼠右肩胛区皮下注射0.2 mL单细胞悬液。注射后，每日观察裸鼠一般状态如饮食、饮水量，皮毛，大便，每3日测体质量、肿瘤生长及周围组织情况，7 d后所有实验动物肩胛区均出现直径约5～7 mm的皮下结节，至此，移植瘤模型建立成功。

将动物模型分为5组，每组5只裸鼠，包括：模型组、顺铂组、滋阴填精方协同顺铂组，滋阴填精方高剂量组，滋阴填精方低剂量组。给药原则：灌胃的液体体积均相同，腹腔注射的液体体积均相同。给药方式：模型组：腹腔注射生理盐水，同时灌胃生理盐水；顺铂组：腹腔注射顺铂液，同时灌胃生理盐水；滋阴填精方高、低剂量组：腹腔注射生理盐水，同时滋阴填精方灌胃；滋阴填精方+顺铂组：滋阴填精方灌胃，同时腹腔注射顺铂液，连续14 d。结束给药第2天，断颈处死，完整剥取瘤组织。

2.4 观察指标

每日观察裸鼠的精神状态、进食量、进水量、活动力、反应力、大便形态等，瘤体生长情况，有无感染及破溃等；每3日测量1次裸鼠体质量。

2.5 HE法检测瘤组织病理结构的变化

瘤组织经福尔马林液固定、石蜡包埋、4 μm连续切片后，HE染色，光镜下观察各组裸鼠移植瘤病理组织学变化。

2.6 免疫组织化学法检测GST-pi、LRP的表达

移植瘤组织经石蜡包埋，连续切片，厚度为4 μm，常温备用。经历脱蜡、复水、免疫、染色、苏木素复染等过程。观察GST-pi、LRP在100和400倍镜下的表达，并随机计数10个高倍视野，IPWIN6032软件计算胞浆内染色面积，取平均值。

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 SKOV3-DDP细胞的耐药性

MTT法检测各组细胞存活率，并计算IC50。结果显示：顺铂作用于SKOV3-DDP及SKOV3细胞24 h后IC50分别为(44.92±1.59) 及(8.95±1.47)μmol/L。计算后，SKOV3-DDP细胞的耐药性为SKOV3细胞的5倍。耐药性较强，可应用于卵巢癌耐顺铂动物模型的建立。

3.2 一般情况

裸鼠成瘤及给药过程中，各组裸鼠精神状态良好，活动正常，反应敏捷，皮肤颜色如常，进食、饮水、大小便未见异常，移植瘤组织未见破溃及感染。

3.3 各组瘤组织病理结构变化

见图1。实验各组瘤体病理图片都出现肿瘤细胞排列紊乱、不规则，部分细胞出现肿瘤细胞边界不清、细胞核较深染、异型性明显等现象。模型组肿瘤细胞生长良好，细胞核染色均匀，少见核固缩、核碎裂；用药组部分细胞出现明显核固缩、核深染，部分细胞出现核碎裂、核边际等细胞凋亡征象，部分细胞则出现坏死征象。

图1 HE染色观察各组移植瘤病理组织变化

3.4 LRP的表达

见表1、图2。LRP是一种肺耐药蛋白，其表达主要位于细胞浆或核膜中，免疫组织化学呈黄褐色染色。图2示，100倍及400倍显微镜下各组裸鼠移植瘤组织中，LRP的表达情况。表1可见模型组LRP表达最多，用药组不同程度减少，与正常组相比，顺铂组+中药组、顺铂组、中药高剂量组均具有显著差异(P<0.05)。

表1 各组裸鼠移植瘤组织LRP表达的比较

注：与正常组相比，□P<0.01,■P<0.05

3.5 GST-pi的表达

GST-pi主要存在于胞浆之中，为黄褐色染色。图3所示为100倍和400倍镜下GST-pi表达的差异性。表2所示，模型组GST-pi表达较强，给药组均显示出GST-pi表达下降。与模型组相比，顺铂+中药组，中药的高、低剂量组均显示出显著的抑制作用，与正常组相比，均具有显著性。

表2 各组裸鼠移植瘤组织GST-π表达的比较

注：与正常组相比，□P<0.01,■P<0.05

4 讨论

铂类耐药是影响卵巢癌疗效及患者死亡率的主要原因之一。顺铂在血浆和细胞外基质中，具有相对惰性，一旦进入细胞中，具有活性，形成蛋白质、DNA、RNA的加合物，是其作用的主要毒性位点。铂类药物耐药机制复杂，与DNA修复异常、细胞表面药泵蛋白促使药物外排、活化细胞内解毒系统、 阻滞凋亡通路的进行、肿瘤细胞微环境异常、细胞内药物毒性降低等密切相关[1-2,4]。

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是机体中催化谷胱甘肽与亲电子物质发生结合的一类酶类，共包含5类，其中以GST-pi与恶性肿瘤关系最为密切[5]，其基因定位于11q13。研究表明，GST-pi在恶性肿瘤组织中表达升高显著，且可能与肿瘤细胞耐药导致化疗失败关系最密切[6-7]。其原因可能包括：GST-pi能催化GSH与化疗药物结合而解毒，导致肿瘤细胞产生耐药性；GST-pi也可与亲脂性药物结合增加其水溶性，促进外排而降低化疗药物的细胞毒作用，引起肿瘤细胞耐药。 很多研究报导证实，在多种耐药的肿瘤组织中，GST-pi呈阳性高表达[8]。体外试验发现，大多数肿瘤组织中存在 GST-pi高表达，而耐药的乳腺癌细胞株 GST-pi的表达量是非耐药株的5倍[9]。卵巢癌以铂类和紫杉醇联合化疗为主要方案，GST-pi阳性表达与铂类耐药密切相关，GST-pi可能成为卵巢癌化疗耐药以及判断远期疗效的一个独立有效的指标。

肺耐药蛋白(lung resistance protein, LRP)因首次被发现在肺癌细胞中高表达而命名，主要分布于胞浆内或核膜上。后续的研究表明，LRP与多种肿瘤的原发及继发性耐药相关[10]，主要介导的耐药为铂类或烷化剂耐药，为预测化疗耐药及结局的重要指标。LRP作用机制复杂，目前尚未完全明确。

中医学认为，化疗药物为攻伐之品，在抑制肿瘤细胞生长的同时，亦对人体精血损伤，从而出现一系列精血损伤的症状，如：面部潮红、口干、少津、低热、恶心、呕吐等。而前期的临床观察中我们发现，经历化疗的病人，大部分会出现一系列精血损伤的症状。所以我们提出：以滋阴填精法调控卵巢癌耐药，临床效果十分显著。滋阴填精方的君药为黄精，具有滋补肺、肾之阴，同时补脾益气的功能。臣药为麦冬和白芍，麦冬可补充肺、胃之阴，白芍又可滋补肝阴，二药同用，既可补充因攻伐之品损伤的阴精，又可助君药滋阴之力；佐使药为生白术，白术可平补肺、脾、肾三气，既可健脾益气，又可缓解攻伐之品对脾胃之损伤，推动药物在体内的运化。

中草药是个巨大的宝库，目前正在研究中的抗肿瘤药，70%～80%来源于自然产物，而中草药是其中重要的组成部分。现代药理学研究表明，很多中草药中的有效成分被证明具有抗肿瘤及逆转肿瘤耐药的作用，如：大黄酸、青蒿素、何首乌、葡萄籽、灵芝多糖、黄芪甲甙等[11-12]。滋阴填精方中的组成药物，其有效成为被证明具有一定的抗肿瘤作用。如：黄精中的有效成分黄精皂甙具有显著的抗肿瘤作用，对卵巢癌及胃癌的耐药菌株有明显的逆转耐药作用；麦冬中有很多糖苷类物质，其中麦冬多糖可显著提高小鼠的免疫功能，并可显著增加小鼠脾脏的重量[13-14]。白芍的主要成分为芍药甙，研究证实，芍药甙与肿瘤免疫密切相关，可以明显增强巨噬细胞的吞噬能力，加强对肿瘤细胞的肃清能力，并可增强M1型巨噬细胞的含量，抑制其向M2型表达[15]。白术中的有效成分能活化并增强网状内皮系统的吞噬功能，促进巨噬细胞的吞噬功能，使巨噬细胞的吞噬百分率，吞噬指数及其溶酶体消化平均较对照组显著增加。研究表明，白术有明显的升白作用，可上调淋巴细胞转化率，增强细胞免疫功能，且明显增高IgG。而以白术为主的方剂可有效促进T细胞免疫功能，其提取物还可以促进肿瘤细胞发生凋亡[16-19]。

综上所述，我们发现“滋阴填精”方的组成药物从不同角度干预了肿瘤细胞的生长及耐药，在本实验中，通过体外培养上皮性卵巢癌耐药细胞株，成功构建卵巢癌耐药裸鼠移植瘤模型，探讨“滋阴填精”方对其耐药性的影响及机理。结果表明，“滋阴填精法”可逆转卵巢癌细胞对铂类的耐药性，其作用机制可能与下调耐药相关蛋白的表达相关。

[1] J. Permuth-Wey, T.A.Sellers. Epidemiology of ovarian cancer[J].Methods in Molecular Biology,2009，472:413-437.

[2] A. Jemal, R. Siegel, E. Ward, et al. Cancer statistics[J].Cancer Journal for Clinicians,2008,58(2):71-96.

[3] 闫珺，赵磊，刘松江.虫类药治疗卵巢癌的研究概况[J].中医药信息,2016,33(5):111-113.

[4] Zhi Jiang, Bao-An Chen, Guo-Hua Xia, et al.The reversal effect of magnetic Fe3O4nanoparticales loaded with cisplation on SKOV3/DDP ovarian carcinome cells[J].International Journal of Nanomedicine,2009,4(4):107-114.

[5] Gigante M, Toffoli G, Bertola A. Radiosensitivity in multidrug-resistant and cisplatin resistant human carcinoma cell lines[J].Am J Clin Oncol,2003,26(4):73-79.

[6] RP Perez. Cellular and molecular determinants of cisplatin resistance[J].Eur J Cancer,1998,34(10):1535-1542.

[7] C Meijer, A Timmer, EG De Vries.Role of metallothionein in cisplatin sensitivity of germ cell tumours[J].Int J Cancer,2000,6(85):777-781.

[8] 李国材，石景森.P-糖蛋白和谷胱甘肽S转移酶在胆囊癌的表达及临床意[J].现代肿瘤医学，2011,19(4):727-730.

[9] Batist G, Tuplule A, Sinha B K, et al. Over expression of a novel anionic alutathione transferase in multidrug-resistant human breast cancer cells[J].J Biol Chem,1986,261(33):15544-15549.

[10] 张桂香，刘金萍，李心兰.MDRl、BCRP和LRP基因在乳腺癌组织中的表达及其意义[J].西安交通大学学报，2012，33(1):79-83.

[11] 王华，刘霞．葡萄籽原花青素抗癌活性及其机制研究进展.安徽大学学报[J].第三军医大学学报,2012，4(21):24-27.

[12] 康讯雷，黄新志.大黄素抑制肿瘤细胞HIF-1克服化疗耐药的机制涉及活性氧对SUMO的影响[J].中国肿瘤学杂志，2013，5(3)：35-39.

[13] 刘跃亮，罗进勇，曾照芳.双氢青蒿素对骨肉瘤细胞143B影响的研究[J].激光杂志,2012，4(26):348-350.

[14] Jiang D, ChenY, Hou X. Influence of Paeonialactiflora roots extract on cAMP-phosphor-diesterase activity and related anti-inflammatory action[J].J Ethnopharmacol,2011,137(1):914-920.

[15] 吴勃岩，韩玉英，梁颖，等.龙牙楤木叶总皂苷抗肿瘤作用机理研究[J].辽宁中医杂志，2009，37(1)：175-179.

[16] Wu CR,Jiang X,He ST,et al.Effects of QWBZP on T-cell subsets and their cytokines in intestinal mucosa of HRV infection suckling mice[J].J Ethnopharmacol,2010，131(1):130-134.

[17] 马艳春,韩宇博,贾晓聪,等.中医药治疗肾细胞癌的现状分析及展望[J].中医药学报,2015,43(1):81-83.

[18] 赵晓宁,薛文翰.健脾化瘀方联合化疗治疗晚期胃癌疗效及对生活质量的影响[J].中医药学报,2016,44(3):105-108.

[19] 王宽宇,陈静,赵可君,等.扶正消岩汤对EMT-6乳腺癌荷瘤裸鼠免疫功能的影响[J].中医药学报,2016,44(1):55-57.

2016-07-17

2016-12-09

国家自然科学基金项目(81173293)

王春梅(1982-)，女，博士，主治医师，研究方向：中医药治疗妇科肿瘤。

*通讯作者：薛晓鸥(1963-)，女，博士，主任医师，研究方向：中医药防治妇科肿瘤。

R285.5

A

1002-2392(2017)03-0001-04