小鼠脾脏胚后发育细胞的增殖规律研究

唐丽江，孙振华，汪凤媛，顾棚，彭西

（1.成都农业科技职业学院畜牧兽医分院，四川 温江 611130；2.四川农业大学动物医学院，四川 温江 611130；3.西华师范大学，四川 南充 637002）

小鼠脾脏胚后发育细胞的增殖规律研究

唐丽江1，孙振华1，汪凤媛2，顾棚2，彭西*3

（1.成都农业科技职业学院畜牧兽医分院，四川 温江 611130；2.四川农业大学动物医学院，四川 温江 611130；3.西华师范大学，四川 南充 637002）

本试验以健康昆明小鼠为研究对象，研究不同日龄小鼠脾脏胚后发育细胞的增殖规律，以探讨脾脏发育与功能的关系。结果显示：随着小鼠日龄增加，脾脏脏器指数增加，结构日益清晰，支持组织及小梁逐渐增多，分界明显，淋巴滤泡随日龄逐步增大，且与周围组织分界渐清晰，25、50日龄时在红髓与白髓区均可见较多的巨噬细胞。根据组织结构与免疫功能的关系，随着日龄增长，脾脏结构逐步发育成熟，免疫功能迅速增强。

脾脏指数；脾脏结构；小鼠

脾脏是机体外周最大的免疫器官，具有造血、储血、滤血及免疫功能。尤其是脾脏的免疫功能在机体淋巴器官中占有重要的地位。本研究采用昆明小鼠为试验对象，研究不同日龄小鼠脾脏胚后发育细胞的形态学、细胞周期及细胞凋亡的变化，以探讨脾脏组织结构发育与免疫功能的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康怀孕昆明雌鼠30只，购于华西医学培育中心，幼鼠于20日龄断乳后雌雄分笼饲养。饲养条件：温度控制在 20～25℃，自然照明，自由饮水和摄食。

1.2 脾脏指数测定及形态学观察 分别取5、10、25、50日龄小鼠10只，称量小鼠个体重，颈椎脱臼致死后取脾脏，小心地剥离脏器外周结缔组织，用滤纸吸去血渍，称重，计算脏器指数。计算公式如下：

器官指数=器官重（g）/体重（kg）

将脾脏制作成常规石蜡切片，采用H.E.染色法染色后[1]，400倍光镜下观察脾脏的基本形态结构。

1.3 脾脏的细胞周期和凋亡检测 随机抽取10、25、50日龄小鼠各5只，剖杀，立即取适量脾脏组织块，用机械法制成细胞匀浆，300目筛过滤后，500～800r/min低速离心，弃上清液，以pH值7.0～7.4的PBS洗两次后，调整细胞浓度为1×106个/mL。细胞周期检测：细胞液经过PI染液染色后，用流式细胞仪检测处于静息期（G0G1），DNA合成期（S期）及分裂期（G2M）细胞所占的数量百分率，并计算增殖指数（PI）。计算公式如下：

细胞凋亡检测：取100μL细胞悬液于流式管中，加入5μL膜联蛋白V-FITC和5μL PI染液，轻微振荡混匀，室温避光染色15min；加入400μL结合缓冲液，振荡混匀，用流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析早期凋亡细胞的百分率。

1.4 数据处理 用SPSS11.5软件进行数据统计、分析，用单因素方差分析进行显著性检验。

2 结果

2.1 脾脏脏器指数 由表1得出：10日龄小鼠的脾脏脏器指数显著高于5日龄（P＜0.05），25日龄和50日龄的脾脏脏器指数极显著高于5日龄（P＜0.01）。表明随着日龄增长，脾脏逐渐发育成熟。

表1 脾脏脏器指数检测（×1000）

2.2 脾脏胚后发育的形态学变化 随着小鼠年龄的增长，脾脏结构日益清晰，脾脏支持组织增多，小梁逐渐增多，分界明显，淋巴滤泡逐步增大，且与周围组织分界渐清晰；同时，脾脏内巨噬细胞数量逐渐增多，尤其是25、50日龄时在红髓与白髓区均可见较多的巨噬细胞。

2.3 脾脏中细胞周期变化 流式细胞仪结果显示（表2）：小鼠从10日龄开始，G0G1期细胞百分率呈下降趋势，G2M期和S期细胞数量呈上升趋势（P＞0.05），PI值也呈上升趋势，但差异不显著（P＞0.05）。

表2 脾脏细胞周期各时相变化

表3 小鼠脾脏细胞各日龄凋亡率的变化

图1 小鼠脾脏细胞凋亡随日龄增长的变化

2.4 脾脏中细胞凋亡变化 流式细胞仪检测结果如表3和图1所示。结果表明，随着日龄增加，脾脏细胞的凋亡呈现不稳定的趋势。与10日龄比较，25日龄时，脾脏细胞的凋亡率极显著升高（P＜0.01），50日龄时变化不明显（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 脾脏胚后发育形态学观察 据报道，提高小鼠免疫脏器指数（包括胸腺、脾脏指数），有利于增强小鼠的免疫功能[2]。本试验结果显示：10日龄时小鼠脾脏脏器指数显著高于5日龄（P＜0.05），25日龄和50日龄时的脾脏脏器指数极显著高于5日龄（P＜0.01）。

3.2 脾脏胚后发育的形态和结构变化 脾脏是机体最大的外周淋巴器官，是免疫活性细胞受到抗原刺激后增殖分化的场所，小鼠从出生到性成熟，脾脏随小鼠日龄的增长而逐渐增大，其内部结构也发生较大的变化。淋巴滤泡又称脾小结或脾小体，是脾实质的主要组成部分，由B淋巴细胞聚集而成，脾淋巴滤泡的生发中心是淋巴细胞增殖、生成的部位，其数量、体积反映了活性程度[3]。小鼠在出生后2～3d才出现脾小结，生发中心不明显。有报道指出，随着日龄增长，脾脏各种特征结构不断发育成熟，7日龄时具备近似成熟的组织结构，但直至35日龄才趋于稳定。本试验观察到随着小鼠年龄的增长，脾脏指数增加，结构日益清晰，支持组织及小梁逐渐增多，分界明显，淋巴滤泡随之逐步增大，且与周围组织分界渐清晰，25、50日龄时在红髓与白髓区均可见较多的巨噬细胞。根据组织结构与免疫功能密切相关的说法[4]，随着日龄增长，脾脏免疫功能迅速增强，发育好的脾小体生发中心可见树突状细胞（DC）及巨噬细胞，位于脾网架结构及白髓间的红髓使血流缓慢，从而使抗原与吞噬细胞的接触成为可能，红髓内抗原递呈细胞（APC）与T、B细胞直接接触，递呈抗原，然后发生免疫反应。B淋巴细胞受病原体刺激后，引起一系列变化，最终转化成能产生抗体的浆细胞。

3.3 细胞周期与细胞凋亡变化 关于细胞凋亡的报道，有学者认为，就免疫器官中的免疫细胞而言，凋亡的细胞需要通过细胞增殖来补充；淋巴细胞发育分化，不论是胸腺内的淋巴细胞，还是脾脏内的淋巴细胞，都存在着阳性选择和阴性选择，阳性选择是发育中对细胞死亡的拯救过程，而阴性选择是通过细胞程序性凋亡而使细胞死亡的过程[5]，当细胞增殖增多时，细胞凋亡将减少。又有说法认为，细胞凋亡是为了保持机体自身组织稳定、调控自身细胞增殖和死亡之间的平衡，且保证细胞周期各时相的顺利通过，细胞增殖不会阻滞于任一时期，这为细胞凋亡创造了条件[6]，故细胞增殖与细胞凋亡有着相同的趋势。本结果显示，小鼠发育至25日龄时细胞凋亡达到一个高点，而细胞周期结果也显示，在25日龄时细胞增殖达到最高，与前者结果相同，可能是细胞增殖分化过程中自由选择的结果。

[1] 王伯沄，李玉松，黄高昇，等.病理学技术[M].北京：人民卫生出版社，2000.

[2] 王卫国，方娜.谷朊粉酶解物对小鼠生长性能和免疫脏器的影响[J].粮食与饲料工业，2010（15）：56-59.

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[4] Mast J，Goddeeris B M.Development of immunocompetence of broiler chickens[J].Vet Immunol Immunopathology，1999，70（34）：245-256.

[5] 李奎，孙桂荣，康相涛，等.固始鸡免疫器官内细胞增殖动态变化[J].中国兽医学报，2008，28（8）：953-956.

[6] 刘丽，金宏，王先远，等.大豆异黄酮对电离辐射小鼠脾脏细胞周期、凋亡与增殖的影响[J].中国应用生理学杂志，2006，22（4）：497-500.

The Cell Proliferation Laws of Spleen During Postembryonic Period in Mice

Tang Lijiang1，Wang Fengyuan2，Peng Xi3*，et al.
（1.Department of Animal and Veterinary Science，Chengdu Agricultural Science and Technology Vocational College，Sichuan Wenjiang 611130；2.College of Veterinary Medicine of Sichuan Agricultural University，Sichuan Wenjiang 611130；3.China West Normal University，Sichuan Nanchong 637002，China）

In this experiment，healthy Kunming mice were used to study the cell proliferation laws of the spleen，the relationship between the morphological structure and the immunological function was also discussed.The result showed that during the growth of mice，the structure of spleen was more and more clear，and the supporting tissue and trabecula increased with obvious boundary.The lymph follicles increased gradually and had a clear limit out of the surrounding tissue with the increase of age.There were more macrophages in the red pulp and white pulp area when the mice were 25 and 50 days old.According to the relationship between tissue structure and immune function，with the increase of age of the mice， the spleen structure developed gradually and the immune function increased rapidly.

Spleen index；Spleen structure；Mice

S852.167

B

1001-8964（2017）06-0026-02

2017-02-12

唐丽江（1985-），女，硕士，讲师，研究方向：动物解剖生理学。

*通讯作者：彭西