西兰花茎叶多肽的酶法提取及其增强免疫力功能研究

党亚丽,么春艳,周亭屹,俞 盈,李青青,吴庆其

(浙江省医学科学院,浙江杭州 310013)



西兰花茎叶多肽的酶法提取及其增强免疫力功能研究

党亚丽,么春艳,周亭屹,俞 盈,李青青,吴庆其

(浙江省医学科学院,浙江杭州 310013)

本文对西兰花茎叶多肽进行酶法提取以筛选增强免疫力功能活性强的组分。从西兰花茎叶中提取粗蛋白后,首先经酶法制备西兰花多肽,然后采用Valflow50超滤、Sephadex G-15进行分离纯化,得到分子量为310～2600 Da的西兰花小肽,并对其进行增强免疫力功能的动物实验研究,分别以100、50、25 mg/kg·bw 3个剂量的西兰花多肽提取物对小鼠连续灌胃30 d,然后分别测定小鼠的体液免疫功能、细胞免疫功能和单核-巨噬细胞功能。结果表明,高剂量组(100 mg/kg)西兰花多肽提取物对小鼠的淋巴细胞转化能力(0.225± 0.040)与小鼠的左右耳片重量差异(18.19±2.94) mg均显著高于空白对照组(p<0.05)。西兰花多肽提取物对正常小鼠碳粒廓清功能有非常明显的促进作用,碳廓清指数分别为(0.126±0.052)和(0.136±0.022),高、中剂量能显著(p<0.05)增加小鼠非特异免疫功能。以上结果表明西兰花多肽提取物具有增强免疫力的功能,此研究可为西兰花的深度开发和综合利用提供基础数据和科学参考。

西兰花,多肽,提取,增强免疫力

西兰花(BrassicaoleraceaL.var.botrytisL)又名青花菜,为十字花科芸薹属二年生植物,被誉为“蔬菜皇冠”,内含丰富的生物活性物质,其中包括萝卜硫素、多糖等抗肿瘤活性物质和多酚、黄酮等多种抗氧化活性物质,此外蛋白和氨基酸含量也较高,具有非常高的食用和药用保健价值[1]。

国外已有研究证明萝卜硫素具有增强免疫力功能[2]。美国《营养学》杂志也刊登了西兰花能有效预防前列腺癌的研究成果[3]。Shapiro TA[4]等人通过临床实验比较了西兰花芽提取物中的葡糖异硫氰酸盐、萝卜硫苷以及莱菔硫烷异硫氰酸盐的安全性、耐受性及在体内的代谢。周向军[5]等报道从Broccolini(西兰花与中国芥兰的杂交品种)叶中提取的黄酮可抑制人类肿瘤细胞株SW480、HepG2、Hela和A459等增殖,并能诱导SW480细胞株凋亡,但有关将西兰花多肽分离增强免疫力方面的研究鲜见报道。

具有强化人体免疫功能的多肽应用于临床,如胰岛素、生长激素、释放抑制素Somatostatin、脑活素多肽疫苗等。荣建华等[6]研究了大豆多肽对小鼠免疫功能的影响,结果表明大豆多肽能显著增加小鼠免疫器官的重量,增强机体非特异性免疫功能,还有证据表明大豆多肽可防治肿瘤,对肿瘤的生长有一定的抑制作用[7]。

免疫力低下已成为当今社会人们日益重视的健康问题,研究和发现那些可增强人体免疫力,防止疾病发生的食品和保健品也是目前研究的热点之一,对西兰花活性多肽进行分离纯化,并进行增强免疫力功能的研究,可为西兰花的精深加工和开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜西兰花茎叶 浙江省台州天莱生物技术有限公司；Sephadex G-15 sigma公司;碱性蛋白酶Alcalase 2.4L FG novozymes公司；实验动物 实验选用清洁级健康ICR小鼠,体重18～22 g,单一雄性,浙江省医学科学院实验动物中心提供,实验动物生产证许可证号SCXK(浙)2014-0001。饲养于浙江省医学科学院实验动物中心SPF级动物房,实验条件保持温度为25 ℃,相对湿度为40%～70%,光照-黑暗循环为12 h∶12 h,自由饮水摄食；RPMI1640、FBS、Hank’s液、ConA、MTT、异丙醇、HCl、DNFB、丙酮、麻油、生理盐水、印度墨汁、Na2CO3。

Sartorius vivaflow 50回旋流/切向流超滤器 德国赛多利斯公司;FD-1B-50型冷冻干燥机 北京博医康仪器有限公司;Waters600高效液相色谱仪 配2487紫外检测器和M32工作站，美国Waters公司;UV-1700型紫外可见分光光度计 日本岛津;SartoriusRSA224S型电子天平 赛多利斯科学仪器北京有限公司;Pellicon® 2 mini Cassette(Millipore Corporation)、HD-3型紫外检测器、BSZ-100型自动部份收集、HL-2型恒流泵 上海沪西分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 西兰花茎叶中蛋白的提取 以西兰花新鲜茎叶为原料进行压榨,所得汁液进行加热,温度为90 ℃,保温10 min,沉淀物经离心,干燥,即得西兰花蛋白粉(蛋白质含量为4.1%)。

1.2.2 西兰花茎叶中多肽提取物的酶法制备 以西兰花蛋白粉为原料,按料液比1︰20加入蒸馏水,在温度60 ℃、pH8.0条件下,加入2.0%的Acalase碱性蛋白酶,酶解3 h后,灭酶,冷却,并经离心,旋转蒸发,浓缩后冷冻干燥,得到西兰花多肽提取物备用[9]。

1.2.3 西兰花多肽含量测定 采用Folin酚法[10]。

1.2.4 西兰花多肽提取物的相对分子质量分布 凝胶过滤色谱法测定[11]。取冻干样品,用高效液相色谱仪进行测定,具体条件为:色谱柱:TSK gel 12000 SWXL 300 mm×7.8 mm;流动相:乙腈/水/三氯乙酸45/55/0.1(V/V);检测器:220 nm;流速:0.5 mL/min;柱温:30 ℃;进样体积:10 μL。用GPC数据处理软件,将样品的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算,即可得到样品的肽相对分子质量及其分布范围,用峰面积归一化法可计算出不同分子量范围肽的近似百分含量。

在TSKgel2000 SWXL体积排阻色谱柱上,以乙腈/水/三氯乙酸(44/55/0.1,V/V)为洗脱剂,以细胞色素C(MW12,500 Da)、抑肽酶(MW6,500 Da)、杆菌酶(MW1,450 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451 Da)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189 Da)为相对分子质量标准品。标准曲线的回归曲线方程为:lgMW=7.20-0.230T,相关系数R=0.9953,表明各相对分子质量对数与各标样的洗脱时间呈较好的线性关系,得到西兰花多肽提取物的相对分子质量分布。

1.2.5 西兰花多肽提取物的初步纯化实验 西兰花多肽提取物进行超滤(MW<5000 Da),然后用G-15凝胶柱分离,洗脱条件为:洗脱液为去离子水,流速15 mL/h,上样量100 mg,重复收集三个西兰花小肽分离组分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,经过滤,蒸干,并多次收集干燥备用。

1.2.6 西兰花多肽提取物增强免疫力功能的动物实验

1.2.6.1 动物分组与给药剂量 实验动物根据体重随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 三个大组,每大组40只小鼠。其中Ⅰ组小鼠进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化;Ⅱ组小鼠进行耳廓肿胀实验;Ⅲ组小鼠进行小鼠碳廓清实验。每大组40只小鼠分成空白对照组(蒸馏水,10 mL/kg·bw)、西兰花多肽提取物组(100、50、25 mg/kg·bw)3个剂量组,每组10只。各组小鼠每天灌胃1次,灌胃量0.1 mL/10 g·bw,空白对照组给予同等体积蒸馏水,连续灌胃30 d后测定各项增强免疫力功能指标。

1.2.6.2 实验方法 脏/体比值测定、细胞免疫功能测定包括ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验-MTT法和二硝基苯(DNFB)诱导的小鼠迟发型变态反应(DTH)-耳肿胀法及其单核-巨噬细胞功能测定-小鼠碳廓清实验均参照卫生部《保健食品检验与技术评价规范》(2003)进行[12]。

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 西兰花多肽提取物的相对分子质量分布

由图1、表1可知，西兰花多肽提取物中的肽相对分子质量主要分布在1000 Da以下,此条件下小肽含量为89.41%,说明酶解对西兰花蛋白粗提物的水解程度很大,已经将大部分的西兰花蛋白质水解成小肽及氨基酸,下一步选用凝胶柱G-15进行进一步分离。

图1 西兰花多肽提取物的分子质量分布 Fig.1 Proportion of different molecular weight of peptide in broccoli注:图中标注的数据为分子量。

2.2 西兰花多肽提取物的分离纯化

用超滤和凝胶柱G-15对西兰花多肽提取物进行进一步分离纯化,结果如图2。经分离纯化后得出3个含量相对较高的组分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),下一步拟对其进行收集与纯化、功能评价及其结构鉴定。

表1 西兰花多肽提取物的不同相对分子质量及其相对含量Table 1 Proportion of different molecular weight of peptide in broccoli

表2 西兰花多肽提取物对小鼠免疫器官脏/体比值的影响(x±s)Table 2 Effect of polypeptide extract in broccoli on the ratio of immune organs and body weight in mice

注:多组间差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),*p<0.05,**p<0.01,与空白对照组比较,表3、表4同。

表3 受试物对Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞转化及迟发性变态反应(DTH)Table 3 Effects of splenic lymphocyte transformation and delayed allergic reaction induced by Con A in mice

图2 西兰花小肽凝胶柱G-15分离结果Fig.2 Purification result of Sephadex G-15 for taste-active peptide of broccoli

2.3 西兰花多肽提取物增强免疫力功能动物实验结果

2.3.1 西兰花多肽提取物对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响 由表2可知,50 mg/kg西兰花多肽提取物(酶解粗提物)能显著增加小鼠脾重。脾系数与空白对照组相比,具有显著性差异(p<0.05),而高(100 mg/kg)、低(25 mg/kg)两个剂量组对小鼠脾系数无统计学意义(p>0.05)。三个剂量对小鼠胸腺系数没有明显影响,与空白对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。

2.3.2 西兰花多肽提取物对细胞免疫的影响 由表3可看出,西兰花多肽提取物高剂量组(100 mg/kg)对小鼠的淋巴细胞转化能力与小鼠的左右耳片重量差异均显著高于空白对照组(p<0.05),中、低剂量组与空白组比较差异不显著。结果表明西兰花多肽提取物具有促进小鼠淋巴细胞增殖、转化能力的作用,能显著增强DNFB诱导的小鼠迟发型变态反应的作用。

表4 西兰花多肽提取物对小鼠碳粒廓清能力的影响Table 4 Effect of polypeptide extracts in broccoli on blood carbon clearance ability in mice

2.3.3 西兰花多肽提取物对单核-巨噬细胞免疫的影响 由表4结果显示,与正常对照组相比较,西兰花多肽提取物对正常小鼠碳粒廓清功能有非常明显的促进作用,高、中剂量能显著(p<0.05)增加小鼠非特异免疫功能。

综上所述,西兰花多肽提取物在小鼠脾淋巴细胞转化能力、小鼠左右耳肿胀度差、小鼠碳廓清实验中,结果与空白对照组相比具有显著差异,说明西兰花多肽提取物具有增强免疫力的功能。

3 讨论

免疫力低下就是防御疾病能力的减弱。人之所以能在各种环境中健康地生存,人体免疫系统起着决定性的作用。现如今,约有万分之一左右的人,由于营养不良等多种因素引起免疫力降低,使得免疫活性细胞不能识别突变细胞,使其生长繁殖,最后发展成为癌症。增强免疫力已成为当今人们日益重视的一个保健问题。

本研究采用生物酶解技术,得到西兰花多肽提取物,经动物实验证实其具有增强免疫力功能,下一步将从西兰花茎叶蛋白多肽提取物中筛选出增强免疫力效果较好的小肽组分,从而鉴定其组成,此研究可为西兰花的深度开发和综合利用提供基础数据和科学参考。

4 结论

本研究通过采用煮沸法提取西兰花茎叶蛋白后,对其进行酶解,得到西兰花多肽提取物,接着对西兰花多肽提取物用超滤、Sephadex G-15分离纯化得到肽含量相对较高的组分。

经动物实验表明西兰花多肽提取物具有增强免疫力功能。

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Immunomodulatory effects of the enzymatic extract polypeptide from broccoli stems and leaves

DANG Ya-li,YAO Chun-yan,ZHOU Ting-yi,YU Ying,LI Qing-qing,WU Qing-qi

(Institute of Health Food of Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013,China)

The polypeptide extract was gained by enzymatic method from broccoli stems and leaves and its immunomodulatory effects had been studied. The crude protein was extracted from broccoli stems and leaves,and then the broccoli polypeptides were prepared by enzymatic methods. The hydrolysate was isolated by the method of ultrafiltration and Sephadex G-15. The molecular mass of the oligopeptide was 310～2600 Da. The animal experiments were studied on their immunity function. Oligopeptide were consecutively orally given to mice with the doses of 100,50,25 mg/kg·bw(comparatively as 20,10,5 times of recommended human daily dosage)for 30 days. It was determinated for the humoral immune function,the cellular immune function and the mononuclear macrophage function in mice. Results showed that the high dose group(100 mg/kg)of broccoli peptide extracts had high conversion ability(0.225+0.040)and the ear weight were different(18.19+2.94) mg,it was significantly higher than that of control group(p<0.05). Broccoli polypeptide extracts have obvious effect on the normal mice carbon clearance function,carbon clearance index were(0.126+0.052)and(0.136+0.022),high and medium dose significantly(p<0.05)increased the nonspecific immune function of mice. Results showed that the broccoli polypeptide extract could enhance immunity function,which could provide basic data and the scientific reference for the deep development and comprehensive utilization of broccoli.

broccoli;polypeptide;extraction;enhancing immunity function

2016-11-21

党亚丽(1978-)，女，博士，副研究员，研究方向：生物活性物质与保健食品研发，E-mail:dangyali1978@126.com。

浙江省重大科技计划项目(2014C02023)；浙江省医药卫生项目(201473497)。

TS252.54

A

1002-0306(2017)11-0352-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.060