鸡IL—18和IFN—γ协同抗病毒机制分析
2017-06-23李晓婷宋佰芬王歆桐王梦瑶
李晓婷++宋佰芬++王歆桐++王梦瑶++余崴++马金柱++于立权++崔玉东
摘 要：禽病毒性疾病如禽傳染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）一直困扰着养禽业的健康、快速发展。在其他抗病毒感染的药物效果不理想时，有必要应用细胞因子制剂来改善机体免疫并提高抗病毒能力。已证明，鸡白细胞介素18（Chicken interleukin-18，ChIL-18）和鸡干扰素γ（Chicken interferon，ChIFN-γ）对多种病毒感染具有抑制作用。为了研究新型细胞因子制剂，该实验分析了鸡白细胞介素18（Chicken interleukin-18，ChIL-18）和鸡干扰素γ（Chicken interferon，ChIFN-γ）以及二者混合后的抗病毒机制。ChIL-18和ChIFN-γ蛋白注射雏鸡后7d内，应用试剂盒检测雏鸡体内血清中细胞因子的变化情况。利用鸡外周血单核细胞分析ChIL-18和ChIFN-γ对细胞内NO、几种Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）及下游信号通路的影响。实验结果表明，混合组蛋白可刺激雏鸡血清中产生高水平IL-6，IL-12，及IL-17。混合组蛋白可以诱导巨噬细胞中NO的分泌水平显著升高，TLR 2、TLR 3、TLR 4和MHC-II的表达量升高，MAPK和NFκB信号通路被激活。综上结果表明，ChIL-18和ChIFN-γ以及二者协同可诱导机体对病毒感染产生有效的防御作用，为新型细胞因子制剂的研究提供参考。
关键词：鸡白细胞介素18；鸡干扰素γ；抗病毒；免疫调节
中图分类号 S855.3 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）11-0040-07
Synergistic Antiviral Mechanism of Chicken IL-18 and IFN-γ
Li Xiaoting1 et al.
（1College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）
Abstract：The healthy and rapid development of poultry industry was troubled by avian viral diseases such as Infectious Bursal Disease（IBD）. With other anti-viral drug effect is not ideal，it is necessary to use cytokine preparations to improve the immune system and improve the anti-virus ability. Chicken interleukin-18 （ChIL-18）and chicken interferon gamma（ChIFN-γ）have been shown to inhibit a variety of viral infections. In order to study the novel cytokine preparations，the effects of ChIL-18 and ChIFN-γ and the two mixed antiviral mechanism was analyzed. The results of this laboratory had showed that ChIL-18 and ChIFN-γ can inhibit IBDV proliferation in chickens，especially with the mixed group，which indicates that the mixed group has better antiviral effect. Within 7 days after ChIL-18 and ChIFN-γ injection of chickens，the kit was used to detect the changes of cytokines in the chicks. The effects of ChIL-18 and ChIFN-γ on intracellular NO，several Toll-like receptors （TLR）and downstream signaling pathways were analyzed by using peripheral blood mononuclear cells of chickens. The results showed that the levels of IL-6，IL-12 and IL-17 in the serum stimulated by mixed group ware significantly different from those in the PBS group. Mixed group proteins could induce NO production，the expression levels of TLR2，TLR3，TLR4 and MHC-II were increased and MAPK and NFκB signaling were activated. These results indicated that the mixed group had a better theoretical basis for antiviral ability，ChIL-18 and ChIFN-γ，both of which could induce the body to produce effective defense against virus infection and provide reference for the study of new cytokine preparations.
Key words：Chicken interleukin 18；Chicken interferon γ；Antiviral；Immunoregulation
1957年，Isaacs和Lindenmann在研究流感病毒的干扰现象时发现了一种与病毒干扰作用有关的活性物质，命名为干扰素（interferon，INF）[1]。1958年Nagano和KoJima报道了同样的发现[2]，这也是第一个纯化到同质，克隆，测序完全的细胞因子，并以重组的形式生产并被广泛的应用于临床[3]。IFN应答在对病毒的先天免疫中起重要作用[4-5]。病毒入侵诱导许多细胞类型产生IFN，并且IFN作用于邻近的健康细胞以防止进一步的病毒感染。IFN-γ是唯一的Ⅱ型干扰素，又被称为免疫型IFN[6]，主要由活化的T、B淋巴细胞和自然杀伤（Natural killer，NK）细胞产生，是紧密参与先天和获得性免疫应答的促炎性细胞因子[7]。IFN-γ可以有效的刺激NK细胞和巨噬细胞活化[8]，激活抗微生物和抗原呈递功能，在抗胞内病原体的宿主防御中起关键作用[9]。发生免疫应答时，IFN-γ的循环扩增可以快速警告相邻细胞以及先天免疫系统的效应细胞对抗可能的感染。IFN-γ可以广泛的影响细胞程序[10]，也可以引起细胞表面Ⅰ类和Ⅱ类主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）分子的表达增加[11]。IFN-γ具有较为严格的种属特异性。
IL-18在1989年首次在小鼠腹腔内注射内毒素后从血清中分离，被描述为“IFN-γ诱导因子”。许多研究者得出结论，该血清因子是IL-12，直到1995年从小鼠肝脏纯化和“IFN-γ诱导因子”的分子克隆，才更名为IL-18[12]。IL-18属于IL-1家族的第四成员，由巨噬细胞，树突细胞（DC），嗜中性粒细胞，脂肪细胞，枯否细胞，小胶质细胞和大脑中的某些神经元等多种细胞产生。这种细胞因子呈现许多独特的生物学效应，包括多效性、多功能性、免疫应答和促炎作用[13-16]。IL-18与家族中的IL-1β相似，其分泌不通过内质网和高尔基体，然而，IL-18的生物学活性并不能用IL-1β来概括。自1995年以来，许多研究已经使用内源性IL-18或IL-18缺陷型小鼠来研究IL-18的多种生物学功能。已有研究表明IL-18可以刺激激活NK细胞[17]、细胞毒性T淋巴细胞[18]以及对癌细胞生长和转移的抑制作用[19]。
本实验为了进一步研究IFN-γ和IL-18及二者的协同抗病毒活性与机制，对IFN-γ和IL-18及它们的协同免疫调节活性进行了诱导细胞因子分泌、NO产生和TLR表达和通路激活的分析。本实验获得的单一IFN-γ和IL-18蛋白将为产业开发和临床應用奠定了一定的物质基础，对后续的应用研究具有重要意义。在研究结果中，蛋白的协同作用具有较好的抗病毒效果，且具有较单一蛋白更好地免疫调节能力，为新型抗病毒的细胞因子制剂的开发和利用奠定了夯实的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验用动物 14日龄SPF（specific-pathogen-free）级三黄鸡和9～11日龄鸡胚购自大庆兴旺养殖场。
1.1.2 主要试验试剂 ChIL-18和ChIFN-γ为本实验室制备，GM-CSF和VGX（TLR-4抑制剂）购自abcam公司；反转录试剂盒购自Bio NEER公司；质粒提取及DNA纯化试剂盒购自Axygen公司；白介素-2（IL-2），白介素-4（IL-4），白介素-6（IL-6），白介素-10（IL-10），白介素-12（IL-12），白介素-17（IL-17），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒购自云克隆有限公司，NO检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 实验动物处理 原核表达的ChIL-18和ChIFN-γ蛋白为本实验室前期制备，已证明这2种蛋白具有抗IBDV感染的作用（未发表）。14日龄SPF级三黄鸡雏鸡20只，自由采食及饮水。随机分成4组，每组5只，注射制剂分为ChIL-18组、ChIFN-γ组、ChIL-18+ChIFN-γ的混合组及PBS组。给药方式为腹腔注射。实验流程为：对14日龄雏鸡分别以腹腔注射的方式进行初次注射纯化后的浓度为1mg/mL的重组蛋白，每只雏鸡注射200μL，24h后进行二次注射同样水平的蛋白。具体实验方法见表1。分别在注射后1d、2d、3d、5d和7d检测血清中细胞因子IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-12，IL-17的分泌水平。
表1 试验动物分组
[组别 注射方式 数量（只） 14日龄
（mL/只） 15日龄
（mL/只） PBS 腹腔 5 0.2 0.2 IFN-γ 腹腔 5 0.2 0.2 IL-18 腹腔 5 0.2 0.2 IFN-γ+ IL-18 腹腔 5 0.2 0.2 ]
1.2.2 分离雏鸡血清 对注射后雏鸡静脉采血，放于37℃恒温培养箱中静置1h，取出后放入4℃后3h，800g离心10min，吸取血清用于检测细胞因子水平。
1.2.3 细胞因子检测 检测注射蛋白后雏鸡血清中细胞因子的分泌情况。按照Gallus IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-17Precoated ELISA Kit操作步骤进行检测。使用前将试剂盒所提供的Washing buffer（30×）、Dilution buffer R（1×）、Precoated ELISA plate和TMB取出室温平衡一段时间，所有试剂需充分混匀且避免在此过程中产生泡沫。
将血清转入试剂盒所提供的预包被平板条内，每孔50μL。实验过程中需设置标准品孔及空白孔。每孔加入50μl稀释后的Biotinylated antibody，轻轻振动混匀，酶标板上加封板膜，37℃温箱孵育。60min后取出平板，倾倒孔内液体并于无菌滤纸上拍干，每孔加入250μL1×Washing buffer，洗涤3次，每次5min。最后一次洗涤结束后于无菌滤纸上拍干，每孔加入100μL稀释后的Streptavidin-HRP，加上覆膜，37℃温箱孵育30min。取出平板后倾倒孔内液体，再次用1×Washing buffer清洗平板5次，每次5min，最后一次洗涤结束后将平板拍干。加入TMB，37℃静置避光显色。约显色8min后每孔加入Stop solution终止反应。在加入Stop solution 10min内测定平板内各孔450nm波长处的光密度。根据标准品浓度及其对应吸光度值绘制标准曲线并计算其所对应公式，依照公式计算血清中细胞因子含量。
1.2.4 检测巨噬细胞中NO分泌 鸡外周血单核细胞制备。用10mL无菌注射器抽取肝素（100μg/mL），湿润注射器管壁后推出，抽取成年三黄鸡的翅根静脉血5mL，按TBD的外周血淋巴细胞分离液的操作说明分离出淋巴细胞。将细胞浓度调整为1.0×106cells/mL，转移细胞到10cm细胞培养板中，37℃，5% CO2条件下培养4h，弃掉培养基，用37℃预热的培养基清洗3遍，用胰酶将剩下的贴壁细胞消化下来，重新调整细胞浓度到1.0×106cells/mL，于24孔板中加入50ng/mL的GM-CSF继续培养，当细胞密度到80%或90%单层融合状态时，用无血清培养基终止培养12h，给予不同的蛋白组刺激。蛋白刺激24h后取出细胞培养皿，取细胞培养上清液400μL，按照试剂盒中的方法检测上清液中NO的含量。
1.2.5 TLR信号通路分析 提取的巨噬细胞中加入不同组蛋白刺激培养24h后收集细胞按2.2.2中的方法提取细胞总RNA，按2.2.9.3中的方法对TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-7、TLR-9、MHC-I和MHC-II的mRNA水平进行鉴定。对蛋白刺激后的巨噬细胞提取胞内蛋白质，利用western-blot方法检测巨噬细胞中MAPK和NFκB信号通路中p38和p65的表达情况以及其他几种关键蛋白的表达水平。在24孔培养皿中的巨噬细胞中加入蛋白刺激24h后同时加入TLR-4抑制剂（VGX）和1×TCID50的IBDV，用无血清培养基继续培养直至阳性孔完全病变，观察实验细胞孔中细胞的病变情况，利用qRT-PCR的方法定量检测细胞培养液中病毒的复制水平。
1.2.6 数据统计分析 所有的数据进行生物统计学分析，采用SPSS软件进行单因素方差分析，*表示P<0.05为差异显著，**表示P<0.01为差异极显著有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 重组蛋白体内刺激血液中细胞因子检测 使用纯化后的ChIL-18和ChIFN-γ蛋白以腹腔注射方式接种雏鸡，加强注射1天后开始分离雏鸡外周血血清。雏鸡血清中细胞因子检测结果。如图1所示，与PBS组相比，ChIL-18+ChIFN-γ混合蛋白注射后，血清中IL-2的分泌水平有所增加，到第3天之后，细胞因子水平逐渐下降。IL-4的分泌在第1天开始升高，知道7d仍然高于PBS组，3个蛋白组都能明显地升高其分泌水平。在蛋白注射后，IL-6的分泌水平逐渐升高，并在第7天达到高峰，ChIL-18+ChIFN-γ混合蛋白组可以更有效地刺激IL-6的分泌。与PBS组相比，混合组蛋白虽然可以增加IL-10的分泌，但增加的量不高，整体分泌水平都很低。在检测的第2天，IL-12的分泌水平明显升高，之后逐渐下降恢复正常水平，ChIL-18+ChIFN-γ混合蛋白组的刺激分泌效果相对较好，其他两组与PBS没有统计学差异。蛋白组可以刺激IL-17，且在检测的第1天开始分泌，之后逐渐下降，但仍然可以在几天内持续较高的分泌水平。综上，注射蛋白后血清中的IL-4、IL-6、IL-12和IL-17能显著分泌，其中IL-2，IL-10和IL-12的分泌水平较其他组低，证明蛋白刺激可以在体内引起较强的细胞免疫，而在使用PBS刺激的情况下，这几种细胞因子的分泌不明显。结果说明ChIL-18和ChIFN-γ蛋白刺激几种细胞因子分泌具有特异性。
图1 注射蛋白后血清中细胞因子水平
2.2 蛋白诱导巨噬细胞产生NO 以鸡外周血单核细胞制备的巨噬细胞为研究对象，分析蛋白对NO产生的影响。加入ChIL-18、ChIFN-γ、ChIL-18和ChIFN-γ蛋白及PBS刺激巨噬细胞24h，利用试剂盒检测细胞上清中NO的含量，结果如图2所示。与PBS组相比较，ChIL-18和ChIFN-γ蛋白明显刺激细胞产生更多的NO，混合蛋白刺激细胞产生NO相比于ChIL-18组具有明显差异，而相比于ChIFN-γ组没有统计学差异。结果表明混合组蛋白能够更有效地刺激NO的产生，从而使细胞具有更好地抗感染的微环境。
图2 蛋白刺激后巨噬细胞中NO水平的检测
2.3 蛋白激活巨噬细胞中信号通路 在巨噬细胞中加入ChIL-18、ChIFN-γ、ChIL-18+ChIFN-γ和PBS 4组刺激物，继续培养24h后收集细胞提取细胞总RNA，并对TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-7、TLR-9、MHC-I和MHC-II的mRNA水平进行鉴定，结果如图3所示。ChIL-18和ChIFN-γ混合蛋白组刺激后TLR-2、TLR-3、TLR-4和MHC-II的转录水平升高。表明混合蛋白激活了巨噬细胞中这几种TLR的信号，使细胞具有更强的抗感染能力。混合蛋白提高MHC-II的转录水平表明混合蛋白可以更好地激活CD4+细胞免疫应答。
图3 蛋白刺激后巨噬细胞中TLR和MHC的表达情况分析
利用western-blot方法检测MAPK和NFκB信号通路中几种关键蛋白的表达水平，结果如图4所示。蛋白刺激后4～24h检测p38和p65的表达，结果与PBS相比，3组蛋白都能够刺激p38和p65蛋白的表达升高，而ChIL-18+ ChIFN-γ混合蛋白组中蛋白的水平更高，而且蛋白高表达时间延长。ChIL-18+ChIFN-γ混合蛋白同样能刺激通路中其他几种关键蛋白的表达量升高，IκBα降解量增多。表明混合蛋白可以更强烈地激活MAPK和NFκB信号通路并延长通路活化时间。
图4 Western-Blot方法检测巨噬细胞中蛋白水平
在24孔培养皿中的巨噬细胞中加入蛋白刺激24h后同时加入TLR-4抑制剂和1×TCID50的IBDV，用无血清培养基继续培养直至阳性孔出现完全病变，观察实验细胞孔中细胞的病变情况，结果如图5所示。在加入VGX之后蛋白组巨噬细胞仍会发生与PBS组相似的死亡和溶解，表明蛋白并不能抑制病毒感染引起的细胞病变和死亡。qRT-PCR定量分析蛋白组在加入VGX之后细胞培养液中的IBDV含量没有减少。说明TLR-4信号对蛋白发挥的抗病毒感染的能力具有至关重要的作用。
图6 蛋白不能抑制巨噬细胞加入VGX后对病毒的感染
3 讨论
本研究使用原核表达系统表达出的ChIFN-γ和ChIL-18注射到14日龄雏鸡体内，1d后进行二次注射，对注射后7d内的几种细胞因子进行体内分析，检测的细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-17。混合组蛋白能明显提高几种细胞因子的转录水平。作为Th1型细胞免疫的主要效应分子，IFN-γ可以自动扩增Th1应答并交叉调节其他Th型[20]，IL-18不仅诱导IFN-γ产生，也在增强Th1反应中发挥重要作用[21]，本研究结果中混合组蛋白注射后在血清中检测到更高水平的IL-12。与Qiao Y等的研究一致，IFN-γ可以增加IL-12的表达[22]，也有报道表明，IL-18不能诱导IL-12的产生[23]，可能是由于实验的条件不同，所以出现不一样的实验结果。本实验表明，混合组蛋白可以提高IL-4、IL-10和IL-6的水平，已知IFN-γ对Th2和Treg免疫反应具有抑制作用，对促炎性细胞因子的产生具有促进作用，而IL-18可以通过CD14+单核细胞诱导IL-10产生[23]，IL-18还诱导NK细胞，肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生IL-4[24]。实验结果中IFN-γ和IL-18组及混合组蛋白诱导强烈的IL-17分泌，Th17细胞的分化被IL-6、IL-1、TGF-β和IL-21所驱动，IL-1β和IL-18在内环境稳定和炎症条件下促进Th17细胞分化[25]，本实验中IFN-γ和IL-18明显增加IL-6的表达，但由于实验设计缺陷没有检测TGF-β的水平。以上结果说明IFN-γ和IL-18蛋白注射后会引起机体强烈的细胞免疫应答，使机体具有较强的抗病毒内环境。
巨噬细胞是对宿主防御具有重要作用的先天免疫细胞，可以产生介导宿主防御的多种促炎性细胞因子，这些细胞因子的基因表达强烈地受到TLR等模式识别受体与各种内源性炎症因子所调节。所以本实验利用鸡外周血巨噬细胞研究蛋白对细胞产生NO的能力以及对TLR信号通路的影响进行鉴定及分析。结果表明混合组蛋白可以明显提高巨噬细胞培养液中NO的含量，与Schroder K等的研究一致，IFN-γ可以提高巨噬细胞产生NO的水平[9]，IL-18也可以通过促使巨噬细胞表面受体和IL-10的表达而间接诱导NO产生[26]。在TLR家族中，TLR-3、TLR-7、TLR-8和TLR-9位于细胞内区域，识别病毒核酸种类；TLR-1、TLR-2、TLR-4、TLR-5和TLR-6位于细胞表面，主要识别细菌细胞壁成分，TLR-2和TLR-4还能识别病毒结构蛋白。本实验利用qRT-PCR的方法对几种TLR和MHC分子进行转录分析，结果TLR-2、TLR-3和TLR-4的转录水平升高；TLR-5、TLR-7和TLR-9的转录水平没有变化。IFN-γ刺激诱导细胞表面TLR-2和TLR-4蛋白的表达[27]。IFN-γ可以上调巨噬细胞中TLR-9的表达，但本实验结果中TLR-9没有变化，可能是因为在GM-CSF的存在下抑制了TLR-9的转录[28]。IL-18可以增加CD14+单核细胞中TLR-4的表达，而对TLR-2的表达没有影响[23]。另一方面，Radstake等的研究表明在患有类风湿性关节炎患者的滑膜组织中表达TLR-2和TLR-4与IL-18的水平相关[29]。当IL-18处理PBMC时，同样会观察到TLR-2和TLR-4的上调。IFN-γ发挥抗病毒作用，在抗原呈递细胞中诱导MHC-II类分析的表达和运输，并影响吞噬作用和微管形成[30]。混合组蛋白刺激巨噬细胞会引起MHC-II类分子的转录水平明显升高，而MHC-I类分子没有明显变化。这些结果表明蛋白刺激巨噬细胞可以改变细胞内效应分子的表达，使细胞具有更好的抗感染能力。
IFN-γ和IL-18刺激也影响TLR诱导的MAPK和NFκB信号通路的活化。本实验中巨噬细胞在蛋白刺激24小时内利用western-blot分析表明，混合組蛋白可以明显升高p38和p65的表达水平，IFN-γ和IL-18混合组蛋白刺激p38和p65表达升高都持续24h，表明混合蛋白可以激活MAPK和NFκB信号通路并使通路的激活状态延长。之后对MAPK和NFκB信号通路中几种关键蛋白进行表达分析。IκBα作为NFκB的抑制剂，二者具有拮抗作用，通过检测IκBα的降解来反向证明NFκB的激活；细胞对趋化因子的反应性可以通过调节信号分子JNK来观察；转录因子STAT1是IFN-γ应答的关键介质，可以增加组蛋白乙酰化，使TLR下游多种促炎性细胞因子基因的表达增加；C/EBPβ作为TLR诱导的转录因子，可以促进其他转录因子的募集和促炎性细胞因子基因的转录。当JNK、STAT1和C/EBPβ的表达上调时，表明蛋白可以促进多种细胞因子的产生。实验结果与之前的报道一致，IFN-γ和IL-18刺激可以引起NFκB抑制剂IκBα的快速降解[31]，JNK在受蛋白刺激的细胞中普遍存在，而在IFN-γ和混合组蛋白刺激的细胞中磷酸化的JNK水平较高，STAT1被IFN-γ刺激所激活，有研究表明在IFN-γ预处理的巨噬细胞中C/EBPβ的募集也增强[22]，与其一致，本实验结果中IFN-γ和混合组蛋白能明显提高巨噬细胞中C/EBPβ的表达。以上结果表明IFN-γ和IL-18刺激巨噬细胞可以诱导TLR介导的MAPK和NFκB信号通路的激活，促进其他转录因子和炎性细胞因子的表达，并使细胞更敏感。在巨噬细胞中加入蛋白24h后同时加入TLR-4抑制剂和IBDV，结果在加入抑制剂之后，巨噬细胞的抗病毒能力明显下降，表明TLR-4信号对巨噬细胞的抗病毒活性具有重要作用。综上所述，IFN-γ和IL-18都可以诱导机体和细胞产生抗病毒能力，但二者的协同作用效果优于单一蛋白，为后续的抗病毒机制的研究打下夯实基础。
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（責编：张宏民）
