中草药川贝母繁育技术研究进展

胡章薇+熊芹+肖小君

摘 要：该文对名贵中草药川贝母的人工有性繁育和无性繁育两方面的研究进行了总结，同时对目前川贝母繁育技术中存在的问题进行了分析和探讨，以期为川贝母的资源保护及开发利用提供一些参考。

关键词：川贝母；繁育；研究进展

中图分类号 S567.231 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）11-0133-04

Research Progress on the Breeding Technology of Fritillaria cirrhosa D. Don

Hu Zhangwei et al.

（Neijiang Normal University，Neijiang 641100，China）

Abstract：The researches on artificial sexual reproduction and asexual breeding of Fritillaria cirrhosa D.Don were concluded. And the shortages in present raising technology were analyzed and discussed，offering references for resources protection and development of Fritillaria cirrhosa D.Don.

Key words：Fritillaria cirrhosa D.Don；Breeding；Research progress

川貝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）是百合科贝母属的多年生草本植物，其入药成分为鳞茎，具有“止咳圣药”之称[1-2]。因其药用价值高，中药处方量巨大，近年来被无计划盲目地采挖。又因贝母的生理因素及地理环境等条件的限制，其野生资源供不应求，濒临枯竭，己被列入国家三级保护植物名单[3]。近几年有关川贝母的资源可持续利用成为研究热点，现就川贝母的人工有性繁殖以及组织培养等方面作一综述，为其野生资源的保护和合理开发利用提供参考，也可为川贝母的人工栽培提供技术支持。

1 川贝母的有性繁殖技术

川贝母人工种植采用种子繁殖，川贝母种子扁平，呈倒三角状卵形，棕黄色至淡棕黄色[4]。野生贝母地处高原，不易采集种子，在自然环境中川贝母种子的出苗率不高且整齐度也不理想[5]。其中种子休眠期长成为人工繁殖的主要阻碍，原因是贝母种子属于混合休眠，萌发需要经形态后熟和生理后熟[6]。

1.1 解除种子休眠 于婧等[6]人对川贝母种子休眠机制及层积作用效果进行了研究，指出川贝母种皮无吸水障碍，川贝母种子存在形态后熟及发芽抑制物是种子休眠的主要原因，而通过层积作用可有效打破种子休眠机制。前人研究表明[6-7]通过18～7℃渐变温层积处理180d后能使川贝母种子由原胚分化形成线形完全胚，进而解除贝母种子的形态休眠。金兰等[8]用低温对川贝母种子进行不同时间的处理，发现在3～5℃条件下，低温处理3～5个月后种子内的激素和酶发生变化，种子代谢体系开始活跃，从而解除休眠。温度对已破除休眠机制的贝母种子发芽也有影响，胚发育的最适温度在5～15℃，解除生理休眠的适宜温度在20℃左右[9-10]。

马永贵等[5]用不同浓度的生长素和赤霉素处理贝母种子，结果表明：生长素对贝母种子的形态后熟有较好的促进作用，赤霉素对生理后熟有较好的促进作用，运用生长素、赤霉素综合处理更有利于贝母种子休眠机制的解除。生长素对川贝母的胚发育有明显的促进作用，200mg/kg生长素处理，15℃下沙埋层积为最适条件，赤霉素解除川贝母生理休眠，浓度以250mg/kg效果最好。宋廷杰等[10]的研究表明使用40mg/kg的赤霉素对川贝母种子处理32h也可解除其生理休眠。

1.2 播种 生产上川贝母种子播种通常分为秋播和春播2种方式，且任何一种播种方式，种子都需完成后熟成胚[11]。种子在发芽的过程中呼吸活跃，宜播种于阴凉湿润、水分充足稳定、排水良好、富含腐殖质、疏松的砂质土壤。川贝母种子经破除休眠机制后即可播种。刘潮等[12]人对秋播和春播分别进行了研究，秋播应先将川贝母种子层积处理6～8周，待种子胚形态基本发育完全即可播种，盖土厚度应2～3cm为宜，并覆以保温、保湿材料；春播宜在4月中下旬，将当年脱粒种子埋进种子处理床，第二年解冻后，取出种子播种于大田。对于冻土前未成熟的种子，应混以细土做防霉处理，积层于20cm深的处理床，种子积层厚度为10cm，种子层上盖土10cm。刘翔等[13]对川贝母播种时的覆盖物及其覆盖厚度进行研究，结果表明覆盖物以牛粪腐殖土为基质效果最好，牛粪腐殖土+草木灰次之，原土覆盖最差。原因是原土经浇水或大雨后土表自然形成一层壳，使贝母种子无法破土和正常生长。牛粪腐殖土疏松透气，盖度以1cm左右最为合适，而大棚生产中盖土厚度最好不要超过1cm。

1.3 植株生长 马靖等[14]以川贝母“树儿子”期和“灯笼花”期植株为材料，设置荫蔽度、棚高、遮阴网颜色3个因素，以不遮阴作为对照，研究了光照度对川贝母生长特性的影响。通过实验发现，大田栽培中川贝母“树儿子”和“灯笼花”期不宜采取遮阴措施。伍燕华等[15]以4年生川贝母植株为实验材料，设置大旺肥、磷钾肥、叶绿肥共3个不同的叶面肥水平，以清水为对照，研究了叶面肥对川贝母的保花、保果效应。结果指出，在川贝母花期、果期喷施以磷、钾无机元素为主，生长调节剂为辅的复合叶面肥无机元素和生长调节剂的复合型叶面肥，有利于提高川贝母的挂果率。邓小红等[16]研究表明利用黑色地膜对贝母播种床面进行覆盖，对川贝母种子发芽后种苗的长势促进作用明显，黑色地膜起到调节土壤温度、保湿、除去杂草的作用。

2 川贝母无性繁殖技术

2.1 鳞茎繁殖 川贝母的无性繁殖而言，通常有鳞茎繁殖和组织培养这2种方式。鳞茎分切成块按100kg加0.5kg多菌灵处理，每25kg切块盛于塑料编织袋中埋于沙质壤土封存，常温催芽数日，待芽长至1～2mm时，即可播种[17]。避免烂根和减少病虫害，对上年种植过贝母的熟地，应撒生石灰粉消毒[18]。将川贝母鳞茎按厢栽培，按株距约5cm，行距约8cm的标准种植，覆土约10cm[16]，种好后直接在床面覆黑膜并在黑膜两侧覆土固定。李龙秀[19]认为在每年7—9月进行川贝母鳞茎栽培较为合适。郑军等[20]研究表明川贝母种子在播种后第2年、3年继续萌发，导致个体数量增加，作为种源，1a鳞茎可直接作为繁殖材料，而2a和3a的鳞茎作为繁殖材料，则应在采收时进行分级处理。川贝母鳞茎本身入药且繁殖系数较低，且播种后种植2—3a才能采收，采摘年限长。为了快速获得川贝母鳞茎药材，越来越多的学者探索了组织培养的繁殖方式。

2.2 组织培养 利用组织培养的方法繁殖川贝母，相较于传统的繁殖方法更能节省育苗用地、提高繁殖系数、缩短育苗周期、维持母种的优良性状。耿茂林等[21]认为贝母鳞茎再生途径中外植体表面直接生长出小芽或鳞茎，繁殖周期相对较短，适用于川贝母培育。朱丹妮等[22]研究表明，组培川贝母和商品药用川贝母一样具有相同的化学成分和生物碱种类，且降低了对人体有害元素的含量。陈敏等[23]研究结果表明，组织培养物的总生物碱含量是原种及市售川贝母的2～4倍，组培鳞茎与原种鳞茎的游离全蛋白图谱完全一致。因此用组培川贝母代替野生川贝母供药用是可行的，利用组培扩大川贝母药用资源将成为有效途径。

2.2.1 外植体的选择 前人研究表明，鳞片、茎段、叶片、针形幼苗等不同部位均可作为外植体[24-25]。王跃华等[24]研究发现：分化程度高、纤维化严重的茎段诱导率最低，叶的诱导率次之，针形幼苗的诱导率再次之，鳞片叶的诱导率最高。通过选择出苗期（即第1龄期）、开花期（即第4龄期中期）和果实期（即第4龄期后期）3个不同时期的川贝母鳞片叶进行实验后发现：开花期和果实期鳞片叶较成熟且分化程度较高，在培养过程中完成脱分化的时间较长，外植体的启动时间较长，但因鳞片叶中贮存的营养物质较多，产生的再生鳞茎数目多、体积较大；出苗期鳞片叶外植体在培养过程中虽然完成脱分化的时间较短，外植体的启动时间早，但再生鳞茎数目少，生长速度也较慢。李隆云等[26]研究表明鳞茎基部的愈伤组织诱导率最高。这可能与暗紫贝母鳞片叶基部靠近植株根部，细胞分化程度较鳞片叶其它部位细胞弱而使暗紫贝母鳞片叶基部的分生能力较强有关。

2.2.2 外植体的灭菌 川贝母消毒最终目的都是为了获得无菌且具活力的外植体，张波等[27]先用自来水将鳞茎冲洗干净，再用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干，然后无菌条件下用70%的乙醇浸泡1min，灭菌滤纸吸干，最后用0.1%的升汞浸泡消毒10min，无菌水冲洗5次。张振霞等[28]设置5组消毒处理，结果表明，以暗紫贝母鳞茎为外植体，先用流水冲洗2h，经75%乙醇表面消毒后，用0.1%升汞处理8min，最后用无菌水清洗5次的效果最佳，污染率仅为7.5%。俞超等[29]认为0.1%升汞处理后的污染率低于5%次氯酸钠、10%双氧水2种方法，且随处理时间的延长而污染率呈下降趋势，其中处理30min污染率最低。由于选取的外植体细胞较幼嫩，对消毒剂的抵御力较低，用升汞长时间除菌后的外植体在培养过程中易出现褐化、死亡的现象。王跃华等[30]认为在川贝母除菌时加入300～500mol·L-1头孢噻肟钠能加强除菌效果，随着头孢噻肟钠浓度的逐渐增高，川贝母的除菌率也随之增高，其中以每次15d连续2次用浓度为500mol·L-1的头孢噻肟钠除菌效果最好。

2.2.3 培养基 苏新[31]和马吉义[32]在贝母组织培养过程中研究了9种培养基对贝母离体生长的影响，其中包括 MS、改良MS、white、Nitsch、Blaydes、ER、LS、N、和H培养基，其中以MS培养基的使用最广泛，效果最佳，为贝母鳞茎组织培养的最适培养基[21、33-34]，由此可知贝母的诱导以及增殖需要较大的离子浓度。蔡朝晖等[35]通过对暗紫贝母组织培养条件的研究后认为使用液体培养基配合摇床，培养材料生长最快且生物碱含量最高。

2.2.4 激素 川贝母组织培养中的植物生长调节物质主要是细胞分裂素（6-BA、KT等）和生长素（2，4-D、NAA、IBA等）。细胞分裂素类物质主要是促进细胞分裂与扩大，诱导芽的分化。生长素类物质主要是促进细胞伸长、诱导愈伤组织产生，以及试管苗的生根。

2.2.4.1 愈伤组织的诱导 王跃华等[36]选择生长健康长势良好的组培再生川贝母鳞茎接种于浓度配比不同的6-BA和2，4-D的培养基中，45d后对愈伤组织诱导率和愈伤组织生长情况进行统计。结果显示：未添加任何激素的培养基中，愈伤组织诱导率为0，这可能是因为川贝母外植体本身的内源激素含量较低。在添加了外源激素的培养基中，愈伤组织诱导率均有不同程度增加，以MS+6-BA 1.0mol·L-1+2，4-D 0.5mol·L-1的培養基中愈伤组织诱导率最高且愈伤组织质地致密。同时，实验结果表明，低浓度的2，4-D能促进愈伤组织的生长，高浓度的2，4-D抑制愈伤组织的生长，而过量的2，4-D对愈伤组织会产生毒害作用。张波等[27]结果表明NAA 1.2mol·L-1+6-BA 1.8mol·L-1的MS培养基中外植体愈伤组织诱导率最高，达53.3%。王凯萍等[37]研究表明2，4-D 1.0mol·L-1+ NAA0.5mol·L-1+6-BA0.9mol·L-1的MS培养基为最佳愈伤组织诱导培养基。

2.2.4.2 不定芽的诱导 张波等[27]人以暗紫贝母新鲜鳞茎为外植体，在附加不同浓度配比6-BA和NAA的MS培养基上进行离体培养，发现NAA 1.2mol·L-1+6-BA 1.6mol·L-1的MS培养基中外植体不定芽诱导率最高，达73.3%，这与熊增芳[38]的研究结果6-BA 1.0mol·L-1+NAA 0.5mol·L-1组合最有利于鳞茎的分化，分化出的不定芽多且健壮有差异。马吉义[32]同样以暗紫贝母鳞茎作为外植体，结果表明，不定芽诱导的最佳培养基配方为MS+NAA 2.0mol·L-1+6-BA 0.5mol·L-1。究其原因可能与外植体的产地或生长期有关系。

2.2.4.3 鳞茎的再生 一般来说贝母鳞茎再生途径主要有3条：（1）诱导外植体形成愈伤组织，再由愈伤组织分化为不定芽，最后由不定芽形成新的小鳞茎；（2）诱导愈伤组织后愈伤组织内特化的胚形细胞经多次分裂发育成胚状体，进而由胚状体形成小鳞茎；（3）外植体表面直接生长出小芽或鳞茎[21]。陈敏等[23]报道川贝母在一定激素配比的培养基上，再生鳞茎可不经过低温直接产生愈伤组织并进一步分化成小植株。王跃华等[36]将长势良好的川贝母愈伤组织，接入含外源激素6-BA、NAA和KT组合的培养基中，培养45d后统计小鳞茎的诱导率，结果表明，当NAA浓度一定时，KT对鳞茎的诱导效果优于6-BA，诱导产生小鳞茎最佳培养基为MS+KT 3.0mol·L-1+NAA 0.3mol·L-1，诱导率为82.77%。

2.2.4.4 生根 王跃华等[36]以分化出的无根苗接入生根培养基中培养，结果表明，NAA诱导植株生根的效果优于IBA和IAA，0.5mol·L-1的KT不利于诱导植株生根，诱导无根苗生根的最佳培养基为MS+NAA0.3mol·L-1，生根率为83.20%。江明殊等[39]认为川贝母最佳生根培养基为1/2MS+NAA 0.2mol·L-1+IBA0.2mol·L-1，培养30d后生根率为89.17%。陈敏等[23]的研究表明MS+NAA 2.0mol·L-1+KT 1.0mol·L-1+VB 4.0mol·L-1+海柯吉宁12.0mol·L-1这种多种激素协调的培养基可使鳞茎不经低温而产生根，并仅在此培养基上，才能由根诱导产生出愈伤组织，再由愈伤组织分化出鳞茎、芽和根，从而形成完整的植株。张振霞等[28]实验结果表明在1/2MS培养基中添加NAA和IBA对暗紫贝母的生根均有促进作用，其中1/2MS+NAA 0.5mol·L-1的培养基上生根率最高，根生长健壮且生根速率快。

2.2.5 培养条件 光照条件对川贝母鳞茎分化影响较大，在8h/d光照时间，2000Lx光照强度下，对川贝母鳞茎分化的效果最好；完全黑暗条件下，分化效果最差，不定芽个数少，且芽畸形[38]。在贝母组织培养过程中，经低温处理的休眠芽易萌发为胚状体，研究发现低温处理40d的胚状体成苗率最高，这与细胞内过氧化物同功酶的含量与表达有关[40]。同时外植体接种后先经低温处理48h后再进行培养，可有效地抑制外植体内多酚氧化酶（PPO）引起的褐变[41]。

3 展望

目前关于川贝母组织培养的研究大多是针对单一因素进行试验，多因素及复因子共同影响的研究和探讨极少。因此，可以通过对培养基的外源激素、光照强度、培养的温湿度等方面综合研究，来提高川贝母人工繁育速度、缩短生产周期、提高有效活性成分含量，以期早日实现工厂规模化生产。

川贝母的主要活性物是生物碱。国内外对贝母生物碱的研究主要集中在提取分离方法，生理活性的评价，有效成分含量的测定上，对生物碱合成途径的基本框架还不明确，缺乏中间体的证实[42]。未来研究方向应该是进一步补充和完善生物碱生物合成途径及其网络，将其与植物组织培养相结合，在培养基中添加有效前体，进一步研究如何建立川贝母生物碱积累体系，实现目的产物大量积累，以期直接利用组培鳞茎代替部分用药，缓解处方用药供不应求的现状。

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（责编：徐焕斗）