油菜BnERF1基因的克隆及其过表达载体的构建

潘宣丞++杜雪竹

摘要：利用拟南芥ERF1基因的序列，在NCBI数据库中检索油菜（Brassica napus）ERF1基因的序列信息，并设计特异性引物，PCR扩增油菜BnERF1基因。结果表明，成功扩增出油菜BnERF1基因，并构建了过表达载体pCAMBIA2301-ERF1，为进一步研究BnERF1的抗病分子机理和选育新的抗病油菜种质奠定了试验基础。

关键词：油菜（Brassica napus）；ERF1；克隆；载体

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）10-1968-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.042

Cloning of BnERF1 Gene from Rape and Construction of Its Overexpression Vector

PAN Xuan-cheng，DU Xue-zhu

（College of Life Sciences， Hubei University，Wuhan 430062，China）

Abstract：By the sequence of Arabidopsis thaliana ERF1， the sequence information of Brassica napus ERF1（BnERF1） was retrieved in NCBI database. According to the sequence that we found， the unique primer for amplification BnERF1 was designed. Results were confirmed that the gene of BnERF1 and the overexpression vector pCAMBIA2301-ERF1 were successfully obtained. It laid foundation for further research on disease resistance molecular mechanism of BnERF1 and breeding new disease-resistant rape germplasm.

Key words：Brassica napus；ERF1；cloning；vector

油菜（Brassica napus）隸属十字花科芸薹属，是中国一种非常重要的油料经济作物，其种子含油量高达33%～55%。油菜用途广泛，除了能榨取食用油和作物饲料外，还在医药、食品和工业原料等方面均有广泛应用[1]。目前中国的油菜种植面积约为666.7万hm2，占世界油菜总种植面积的1/3[2]。油菜与其他农作物一样，其生长过程受到多种病虫害的危害，导致产量受损。ERF因子是植物特有的一类转录因子家族[3]，其家族成员能够与GCC-box结合[4]，当植物受到致病菌侵害时产生应答反应。

近年来，研究发现ERF家族的B3亚族中大部分转录因子都能在植物受到致病菌侵染时起作用，如ERF1、ERF2和ORA59等[5-8]。在拟南芥中，ORA59能够通过结合PDF1.2（PLANT DEFENSIN1.2）启动子区的GCC-Box来调控PDF1.2的表达，同时可以增强对枯萎病和灰霉病等病害的抗性[9]。在烟草中过表达ERF1，接种TMV后，发现ERF1受到到TMV诱导，表达水平上调抗病性是否增强[10]。同时，ERF1被发现位于JA-ET抗病信号途径的交叉位置[7]。研究表明，ERF1是参与植物的生物胁迫诱导的功能基因，本研究通过同源克隆法获得了油菜的BnERF1基因，构建了BnERF1过表达载体，为今后通过遗传转化选育出新的油菜抗病品种奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蓝型油菜Westar由湖北大学生命科学学院保存。

1.1.2 菌种和质粒 大肠杆菌DH5α菌株和克隆载体B-Zero购于北京全式金生物技术有限公司，改造过的表达载体pCAMBIA 2301由湖北大学生命科学学院实验室保存。

1.1.3 试剂 限制性内切酶和PrimerStar Mix购于宝生物工程（大连）有限公司；15 K DNA Marker、DL2000 DNA Marker和100bp DNA Ladder购于北京全式金生物技术有限公司；1 kb plus DNA Ladder、质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油菜总DNA的提取 取油菜Westar叶片约0.5 g，液氮研磨成粉状，利用2×CTAB法抽提油菜Westar的总DNA，并于-20 ℃储存备用。

1.2.2 油菜ERF1基因的cDNA片段的扩增、克隆和测序 用拟南芥ERF1基因序列作为探针，在NCBI数据库中进行BLAST比对，找到序列同源性较高的油菜序列，设计引物，上游引物为5′-GGGGTACCAGCCACTAACGATCCTAACTGAAAAC-3′；下游引物为：5′-AACTGCAGAGAAACATCGAAA AGCTTAAGGACC-3′。以油菜Westar的总DNA为模板（该基因的DNA没有内含子，所以直接用DNA作为模板），利用引物BnERF1-F和BnERF1-R进行PCR。将PCR产物电泳，切胶回收，连接到B-Zero载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α，将鉴定后菌液送至武汉擎科生物技术有限公司测序。

1.2.3 过表达载体的构建

1）酶切。将测序结果良好的样品，抽提质粒，用KpnⅠ和PstⅠ对重组质粒进行酶切。在干浴锅中37 ℃酶切3 h。酶切完成加入10×Loading Buffer终止酶切，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。

2）目的片段与表达载体的连接转化。将回收的片段与改造过的pCAMBIA 2301载体进行连接，16 ℃连接过夜。将全部的连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布含卡那霉素抗性的LB培养基，37 ℃培养过夜，挑取单菌落，抽提质粒，双酶切鉴定。

2 结果与分析

2.1 油菜总DNA的提取结果

利用2×CTAB法抽提油菜Westar叶片的总DNA后，以121 V电压，1%的琼脂糖非变性凝胶进行电泳检测（图1）。从图1中可以看到，目的条带为一条清晰的条带，同时，OD260 mm/OD280 mm在1.8～2.0，表明无苯酚和蛋白质污染，DNA的纯度较高。

2.2 BnERF1基因的克隆

以BnERF1-F和BnERF1-R为引物，油菜Westar叶片的DNA为模板，利用PrimerStar Mix高保真酶进行PCR克隆了ERF1基因的cDNA片段，PCR扩增产物如图2所示。测序结果表明，ERF1的片段大小为778 bp，与预期结果相符。

2.3 ERF1基因片段的生物信息学分析

该基因含有778个核苷酸，利用NCBI中的ORF软件分析，表明该片段含1个633 bp的开放阅读框（图3），编码1个含有210个氨基酸的多肽。通过BLAST编码蛋白的预测，并与山嵛菜属、荠菜、拟南芥、拟南芥琴亚种、高山芥、苜蓿等植物中的该蛋白进行同源性比对。结果（图4）表明，蛋白序列的同源性较高，分别为88%、88%、87%、85%、83%、86%。进化分析进一步显示出各种植物的ERF1蛋白的进化关系（图5），拟南芥与油菜的亲缘关系最为接近，属于同一个种。山嵛菜、芥菜和油菜的亲缘关系次之，同属一个目。苜蓿与其他相比，和油菜的亲缘关系最远。

2.4 油菜ERF1基因过表达载体的构建

以含有油菜ERF1基因的B-Zero重组质粒为模板，KpnⅠ和PstⅠ酶切出778 bp的片段（图6）。切胶回收后，将其连接pCAMBIA 2301载体上，得到重组质粒pCAMBIA2301-ERF1。

3 小结与讨论

ERF转录因子是植物特有的一类转录因子，其能对植物遭受的生物胁迫和非生物胁迫做出应答反应，从而提升植物对逆境胁迫的耐受力。根據拟南芥中ERF1的序列，在NCBI数据库中进行同源比对，然后根据挑取同源性高的油菜预测序列，设计了特异性引物，直接从油菜DNA中扩增出BnERF1基因，得到油菜ERF1基因。通过对其序列的分析，BnERF1基因全长778 bp，属于ERF家族的B3亚族。通过生物信息学分析，该片段含有ERF家族的功能区，构建BnERF1的过表达载体，为研究该基因的功能奠定了一定的基础。

参考文献：

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