甘草酸微生物转化菌的筛选鉴定及发酵条件优化

苏龙++梁广波++陈光丽++韦玉华++潘雪梅++王雪儒

摘要：首先，采用单因素方法对碳源、氮源、发酵接种量、初始pH、发酵时间、发酵温度等因素进行考查，在此基础上进行4因素3水平的正交试验优化。得到的优化发酵条件是甘草浸出液10%，发酵温度40 ℃，pH 5.0，接种量10%，装液量75 mL/250 mL，发酵时间为6.5 d，180 r/min。在最优条件下，甘草次酸的量达到7.67 mg/mL。

关键词：米曲霉；微生物转化；甘草；甘草酸；甘草次酸；优化

中图分类号：TQ925 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）10-1918-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.030

Screening and Identify of the Glycyrrhizic Acid Microbial Transformation and Optimization of Fermentation Conditions for Glycyrrhetic Acid by Microorganism

SU Long，LIANG Gang-bo，CHEN Guang-li，WEI Yu-hua，PAN Xue-mei，WANG Xue-ru

（College of Biology & Pharmacy of Yulin Normal University，Yulin 537000，China）

Abstract：Firstly，using single-factor test，the effects of these 5 parameters，i.e.，carbon source，nitrogen source，the inoculation amount，initial pH of medium， fermentation time，fermentation temperature on the glycyrrhetic Acid yield were studied. Then the key parameters of fermentation conditions were statistically optimized through the orthogonal array experiments with 4 factors in 3 levels. The optimal conditions were licorice digester liquid 10%，initial pH 5.0，rotation speed 180 r/min，10% inoculum size in 75 mL working volume（in 250 mL flasks） at 40 ℃ for 6.5 d. Using these conditions，the the glycyrrhetic acid yield was 7.67 mg/mL.

Key words： aspergillusoryzae；microbialtransformation； licorice； glycyrrhizic acid； glycyrrhetic acid； optimized

甘草屬于豆科植物。中国西部、俄罗斯及欧洲分布较多。自古以来，甘草在很多国家广为药用，尤其在中国医药学中许多配方都有甘草和甘草浸膏。中医理论认为甘草性平味甘，具有和中缓急、润肺、解毒、祛痰、止咳、通经脉、利气血、调和诸药等功效，为临床广泛应用[1]。近年来，随着药理活性试验方法的发展和完善，发现甘草还具有明显的抗炎，抗溃疡作用和抗变态反应作用[2]。日本学者熊谷朗[3]进一步证明甘草还具有抗病毒性肝炎，慢性肝炎作用。彭子模等[4]也报道了甘草具有抗爱滋病毒的作用。大量研究证明，上述作用主要归因于甘草的主要成分甘草甜素和甘草次酸及其衍生物。因此，甘草次酸及其衍生物的研究开发，是近几十年来各国科学家研究的热点之一。

甘草的肠道代谢及药代动力学研究[5，6]表明甘草酸在肠道内缓慢地转化为甘草次酸。甘草酸经人口服后，血浆中主要测出甘草次酸，而未测到甘草酸。普通和无菌大鼠均给予甘草酸口服，普通大鼠血浆中可以测出甘草次酸，但没有原形物3甘草酸，而在无菌大鼠血浆中未测到甘草次酸。分别口服甘草酸和甘草次酸，血浆中甘草次酸的MRT值出现显著差异，说明肠道内甘草酸缓慢地转化为甘草次酸[7-10]。然而，在甘草中甘草次酸的含量较低，只有0.1%左右，其前体甘草酸的含量则比较高，在3.7%～8.3%。因此，利用微生物与中草药甘草共同发酵生产甘草次酸具有非常重要的意义。

甘草酸与甘草次酸的微生物转化所需的菌株可从土壤中获得，也可以来自植物组织，然而如何从这些众多的菌株当中筛选出能够转化产生有价值的目标产物、且专一性强的菌株，是微生物转化甘草酸和甘草次酸的关键环节，方便、快捷的微生物转化菌株筛选模型的建立是研究的主要内容，也是菌株筛选的有效途径。周艳艳等[11，12]利用筛选到的酵母菌株YGL-B-0发酵培养72 h甘草次酸的含量为11.70 mg/mL。宋新波等[13]利用海枣曲霉分泌的酶转化甘草为甘草次酸，也获得较好的转化效果。徐静等[14]以甘草酸单铵盐为原料，通过酶法转化的方法制备甘草次酸，经过酶解条件的优化后，甘草次酸的得率达到40.87%。陈永强等[15]利用自行筛选的黄曲霉菌株HG-12转化甘草，也很好地提高了甘草次酸的含量。何晨[16]利用纯度为90%的甘草酸为碳源的筛选模型，从新疆野生甘草土壤中分离筛选得到具有水解甘草酸产生甘草次酸的菌株，并采用发酵法转化甘草生产甘草次酸，最终浓度为2.22 g/L，达到产业化水平。王云[17]利用从土壤中分离得到的一种绿色木霉进行生物转化甘草酸，产物为单葡萄糖醛酸基甘草次酸，转化率约为90%。宋素琴等[18]从胀果甘草不同组织中分离得到的149株内生细菌进行筛选，得到一株能产甘草酸类似物的肉生枯草芽胞杆菌。大量的研究证明，用微生物转化甘草酸、甘草次酸具有非常大的应用情景，效益高，获得的目标组分多，但是要获得专一性强的微生物转化菌株和适宜的转化条件还较为困难。加强菌株筛选及其简便、快捷的转化条件研究，对利用微生物转化甘草酸、甘草次酸等甘草成分的工业化生产有重要的意义。本试验详细研究了米曲霉对甘草次酸微生物转化的条件， 优化了转化条件， 为进一步研究甘草次酸的代谢及新药开发提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘草片（玉林市至真药业连锁店），含量90.0%的甘草酸（西安市汇林生物公司），甘草次酸（西安市汇林生物公司），其他试剂均为分析纯（国药集团化学制剂有限公司）。

初筛培养基：甘草酸粉2 g，琼脂2 g，用蒸馏水定容至100 mL，分装，121 ℃高压灭菌20 min。复筛培养基：甘草酸粉2 g，MgSO4 0.05 g、NaNO3 0.5 g、FeSO4 0.001 g、KH2PO4 0.1 g，用蒸馏水定容至100 mL，pH 5.0，121 ℃高压灭菌20 min。发酵基础培养基：甘草浸出液10%，pH自然，分装121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

Tu21800紫外可見分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；HH-s数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）；FE20 Five Easy实验室pH计（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.3 试验条件

1.3.1 菌株初筛 配制好初筛培养基平板，从实验室中草药转化菌种库中筛选能转化甘草酸为甘草次酸的菌株；能在以甘草酸为惟一碳源的初筛培养基上生长的菌株，即为能转化甘草酸为甘草次酸的疑似菌株，用复筛培养基液体培养，通过TLC薄层层析和分光光度法检测甘草次酸，确认转化菌株。

1.3.2 菌株复筛 ①发酵液的TLC薄层层析检测。将初筛菌种菌悬液0.2 mL接入30 mL液体培养基中，30 ℃，180 r/min的摇床中发酵培养120 h，以发酵前作为对照。对发酵液作产物TLC检测，在薄层层析板上有甘草次酸斑点出现的菌株就有可能是能将甘草酸转化为甘草次酸的菌株即目标菌株。薄层层析板的制备：取30 g硅胶G和100 mL 0.3%的CMC-Na水溶液调成糊状，在普通玻璃板上涂匀，室温下过夜晾干，于110 ℃烘干活化30 min，即制成活化的硅胶薄层层析板。甘草次酸标准品的配制：精密称取甘草次酸5 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。发酵液的处理：各取发酵前及发酵后发酵液2.5 mL，加入5 mL乙酸乙酯，振荡、静置分层后将乙酸乙酯于80 ℃水浴中挥干，向挥干物中加入1 mL甲醇，取此甲醇溶液及甘草次酸标准品点样于前述硅胶板上进行TLC展开分析。TLC条件[16，19，20]展开剂：石油醚-乙酸乙酯-醋酸（2∶1∶0.1），各取甘草次酸标准液、发酵前后试液点样于同一硅胶板上。碘显色1 min，至斑点清晰，取出。②发酵液分光光度分析。将初筛的菌种接入复筛培养基中，以10%、50 mL甘草浸煮液作为培养液，30 ℃、180 r/min摇床中发酵4 d。取米曲霉发酵后的甘草液体2.5 mL，加入5 mL的乙酸乙酯放在35 ℃、180 r/min的摇床中萃取，过夜。量取乙酸乙酯层1 mL，依次加入3 mL乙醇、0.2 mL 1%香草醛乙醇溶液和2 mL 80%硫酸，50 ℃水浴10 min，取出放冷，在545 nm处测定OD值[21]。

1.3.3 菌株鉴定 将筛选及纯化好的菌种委托上海美吉生物医药科技有限公司进行鉴定。

1.3.4 甘草次酸标准曲线测定[16] 精密称取120 ℃干燥到恒重的甘草次酸标准品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。得各组成浓度分别为0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的系列标准溶液。以0号空白分别于545 nm处测定吸光度，得回归方程，样品测定利用回归方程计算即得。

1.3.5 单因素试验 以甘草次酸含量为依据，分别考察不同碳源（蔗糖、葡萄糖、麸皮、麦芽糖、玉米粉、淀粉）、不同氮源（蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、黄豆粉、硫酸铵、尿素）、不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、不同接种量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、不同装液量（25、50、75、100、125、150 mL/250 mL）、不同发酵温度（20、25、30、35、40、45 ℃）、不同发酵时间（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 d）对甘草次酸产量的影响。

1.3.6 正交试验设计优化 在单因素试验的基础上以发酵温度、发酵液pH、接种量、发酵时间为影响因素，进行4因素3水平正交试验。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选及鉴定

经过初筛、复筛和发酵检测的筛选，得到一株能把甘草酸转化为甘草次酸的的菌株，结果见图1、图2。将测定的菌株的ITS序列用Blastn软件与GeneBank中已报道的ITS序列进行同源性比较发现，菌种的ITS序列与在GeneBank登记的Aspergillus oryzae（米曲霉）的ITS序列的同源性达到99%；通过对菌株的菌落形态及结合ITS序列同源性比较，可以确定菌种为Aspergillus oryzae（米曲霉）。

2.2 甘草次酸标准曲线测定

根据所获得的不同甘草次酸标准品浓度的吸光度，做出甘草次酸标准曲线（图1）。甘草次酸标准曲线的线性回归方程为y=0.072 3x+0.001 7，R2=0.998。

2.3 碳源和氮源对甘草次酸量的影响

碳源作为微生物生长所需要的营养因子，对微生物的生长代谢起着重要的作用，并且细胞的干物质中碳约占50%，微生物对碳的需求最大；微生物生长和产物合成也需要氮源，主要用于菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物的合成。

从图4、图5可以看出，碳源和氮源种类对甘草酸的转化影响不大，麸皮和淀粉的加入可以增加甘草次酸的含量，但幅度不大；其他碳源的加入相反起到抑制作用。无论是添加有机氮源还是无机氮源，对甘草酸量的影响都差不多。可能是由于甘草药材来源于植物根部，含有多糖类和蛋白质等，经微生物分解后即产生大量碳源和氮源，可满足微生物的生长营养要求。从总体来看，添加碳源和氮源对甘草次酸量的影响不大，另外从成本方面考虑，本系统发酵过程中只以甘草浸出液为碳源和氮源的来源，不另外加入。

2.4 发酵时间对甘草次酸量的影响

由图6可知，随着发酵时间的延长，甘草次酸量逐渐增加，在接种发酵第6.5天时甘草次酸量达到最大；继续延长发酵时间，甘草次酸量有下降的趋势。发酵时间不仅影响微生物的生长速率和生长量，且影响微生物的代谢强度和代谢物的多寡，β-葡萄糖醛酸酶属于米曲霉的次级代谢产物，一般微生物生长到中后期才开始分泌。发酵时间的延长使得菌体的代谢产物β-葡萄糖醛酸酶的含量增大，从而提高甘草酸的转化率。故发酵时间选择6.5 d为宜。

2.5 发酵温度对甘草次酸量的影响

温度是影响微生物生长和存活的主要环境因素之一，对发酵的影响很大。温度的高低影响酶的反应，氧的溶解和传递速率，菌体生长和产物合成等。由图7可知，35 ℃發酵时甘草次酸量最高。20 ℃发酵时甘草次酸量最少，说明20 ℃时米曲霉生长缓慢，还没有酶的分泌或者分泌的酶量较少，甘草次酸量较少。温度过高，虽然菌种生产速度加快，但也有可能营养成分消耗过快，酶的分泌量也减少，导致甘草次酸量下降；也可能温度过高不适合酶的转化反应。

2.6 培养基的初始pH对转化甘草酸的影响

相对于最适pH而言，过高或者过低的pH环境都会影响到米曲霉的生长，也会影响酶的分泌，更影响到酶催化反应。由图8可知，当pH为5.0时，发酵液中的甘草次酸量最高，而pH低于或高于5.0，甘草次酸量相应减少，故最适pH选择5.0。

2.7 菌种接入量对甘草次酸量的影响

由图9可知，随着接种量的增加，发酵液中甘草次酸量逐渐增加，接种量为8%时，甘草次酸量最高；超过8%时甘草酸转化率开始下降。接种量的大小决定于生产菌种在培养中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低生产效率。本试验选择8%为最佳接种量。

2.8 装液量对甘草次酸量的影响

氧气是好氧微生物能正常生长繁殖的重要参数之一。溶氧的多少直接影响微生物生长，并影响β-葡萄糖醛酸酶的产量，进而影响发酵转化率。利用装液量来研究溶氧的影响，装液量小的培养基与氧气的接触面积大，增加液体的溶氧量。反之，装液量大的溶氧量较少。由图10可知，当装液量为75 mL（250 mL三角瓶）时，甘草次酸量最高；装液量过多或过少，甘草次酸产量均减少。装液量与转化环境的溶氧量有直接的关系，增大溶氧量有利于细胞生长、产酶，促进甘草次酸的产生；装液量太少，导致细胞生长过快，营养物质消耗过快，反而会影响酶的分泌，进而影响转化的进行。因此，在转化甘草酸时，培养基的装液量为75 mL/250 mL。

2.9 金属离子对甘草次酸量的影响

由图11可知，Ca2+、Mg2+对甘草酸的转化有一定的效果，可能是这两种离子是β-葡萄糖醛酸酶的激活剂，但甘草次酸增加的幅度不明显；Mn2+具有抑制作用。从金属离子的作用来看，对于米曲霉发酵转化甘草的转化率提高不明显，也有可能因为甘草在种植过程或在后期处理的时候已经携带有金属离子，故发酵过程中也不添加金属离子。

2.10 发酵条件正交试验

正交试验方案及结果分析见表1，表2。通过对正交试验的结果进行分析，可知对甘草酸转化影响因素的排序为B>C>D>A，即pH、接种量对甘草酸转化影响较大，发酵温度、发酵时间对甘草苷转化影响较小。最佳的组合为A3B2C3D2，即发酵温度40 ℃，pH为5.0，接种量10%，发酵时间为6.5 d。经验证在最优条件下，甘草次酸含量最高，达7.67 mg/mL。

3 讨论

本试验通过以甘草酸为惟一碳源的平板筛选法结合薄板薄层层析检测，从实验室的中草药转化菌库中筛选到一株能高效转化甘草酸为甘草次酸的菌株，鉴定为米曲霉。通过单因素和正交试验对米曲霉发酵甘草转化甘草次酸的条件进行了优化。最优的发酵条件为甘草浸出液10%，发酵温度40 ℃，pH为5.0，接种量10%，装液量75 mL/250 mL，发酵时间为6.5 d。在最优条件下，甘草次酸的含量达到7.67 mg/mL。

虽然本试验筛选的菌株经过优化后具备了良好的转化效果，然而，生物反应的技术途径对中草药活性成分的转化非常重要，正确的转化途径是成功的开始。目前在中药活性成分的生物转化技术中，发展起来的有组织细胞培养、微生物转化、肠内菌体内转化、酶促反应及发酵法等。这些技术方法都具有各自的优势和不足，针对不同类型化合物生物转化的特点，开展多途径的转化研究，为筛选合理的工业化生产工艺创造可能性条件。从文献报道来看，实现甘草酸、甘草次酸生物转化的工业化生产还有很长的路要走，在转化技术方法上还需要不断地完善。

致谢：本研究得到广西农产品加工重点实验室（培育基地）、广西重点学科生物化工、农产品深加工与安全技术创新团队资助，谨此致谢！

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