氧化锆/聚亚甲基蓝修饰电极检测CaMV35S启动子基因
2017-06-22徐基贵谈胜福张克营杨柳青
张 娜 徐基贵* 谈胜福 汪 丽 张克营 王 聪 杨柳青
(1 宿州学院 化学化工学院,安徽 宿州 234000;2 宿州学院 体育学院,安徽 宿州 234000)
氧化锆/聚亚甲基蓝修饰电极检测CaMV35S启动子基因
张 娜1徐基贵1*谈胜福1汪 丽1张克营1王 聪1杨柳青2
(1 宿州学院 化学化工学院,安徽 宿州 234000;2 宿州学院 体育学院,安徽 宿州 234000)
制备了基于氧化锆(ZrO2)/聚亚甲基蓝(PMB)修饰电极的无标记DNA传感器,用于转基因植物CaMV35S启动子基因的检测。探针DNA(ssDNA)通过ZrO2和DNA的磷酸基的相互作用修饰到电极表面,以PMB氧化峰的示差脉冲伏安响应为检测信号,传感器和完全互补的DNA片段杂交后,PMB的氧化峰电流明显降低,当和完全不匹配的DNA片段杂交时,峰电流无明显变化。对于完全互补的DNA片段,在2.0×10-12~2.0×10-8mol/L浓度范围内峰电流的变化值和浓度的对数成良好的线性关系,检测限为4.1×10-13mol/L(S/N=3)。所制备的传感器具有良好的稳定性、再生性和重现性,用于样品检测,结果令人满意。
聚亚甲基蓝;氧化锆;DNA传感器;无标记
前言
转基因食品是近些年兴起的一类食品,转基因从一开始就引起了学界的普遍关注,转基因食品的研究对于人们的日常生活具有重要意义。脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质信息的承担者,具有储存和传递遗传信息的功能。转基因食品的DNA片段中核苷酸碱基的特定序列决定了基因的遗传特性,对DNA结构的研究、特定DNA片段碱基排列顺序的研究,以及DNA的突变研究对食品卫生检验和药物筛选等方面具有十分重要的意义。利用核酸分子杂交技术检测特定DNA序列已经成为一个研究热点[1-2]。
电化学DNA传感器是近年来兴起的一种非常优良的生物传感器,能够用于检测基因及一些能与DNA发生特殊相互作用的物质[3-7]。聚合物以其优良的导电性能成为良好的电极修饰材料[8],在传感器中应用十分广泛。更重要是导电聚合物对修饰电极界面性质的改变具有极高的敏感性[9],研究表明特定序列的DNA在电极表面杂交前后会使导电聚合物的电化学信号发生改变[10]。亚甲基蓝(methylene blue, MB)作为一种电子媒介体,其在电极上的性能比较活泼,具有良好的电化学行为,基于电聚合方法制备的PMB修饰电极对一些生物分子具有良好的催化作用[11-13]。ZrO2是一种良好的半导体材料[14-15],研究证明其能够和DNA的磷酸基团发生强的作用,能够为DNA在电极表面的固定提供平台[16]。
本文制备了基于ZrO2/PMB的无标记电化学DNA生物传感器,研究了该修饰电极在检测转基因植物CaMV35S启动子基因中的应用[17],实验结果显示所制备的传感器具有较好的选择性和灵敏性,进而构建了检测新型的转基因植物CaMV35S启动子基因的新方法。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
电化学工作站CHI660D型(上海辰华仪器公司),电化学测定使用三电极体系:裸玻碳电极和修饰电极作为工作电极,铂电极作为辅助电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极。TG16离心机(湖南英泰仪器有限公司),KQ5200DB型号数控超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。
所使用的DNA序列分别为:
探针DNA:5′-TCT TTG GGA CCA CTG TCG-3′;
完全互补DNA:5′-CGA CAG TGG TCC CAA AGA-3′;
完全错配DNA:5′- GCT TCC ATC GAG ATC GTC-3′。
磷酸缓冲盐溶液PBS(0.1 mol/L,pH=7.0):采用磷酸氢钠和磷酸二氢钠混合配制溶液,用H3PO4和NaOH调节溶液的pH值。
DNA杂交溶液:含氯化钠(0.1 mol/L)的PBS(0.1 mol/L),pH=7.0)。
用N2除去溶液中的氧,实验所需用水均为二次蒸馏水。
1.2 ssDNA/ZrO2/PMB/GCE的制备
把裸的玻碳电极使用1.0、0.3及0.05 μm Al2O3粉末打磨抛光,依次用无水乙醇、水超声清洗1 min后,晾干。把已经处理的玻碳电极置于含有MB(3 mmol/L)的PBS(0.1 mol/L,pH=7.0)中,在-0.6~ 0.6 V的电位范围内以100 mV/s的扫描速率循环伏安扫描20周,用水淋洗,制备的电极称为PMB/GCE。然后将该电极置于含KCl(0.1 mol/L)的氧氯化锆(5 mmol/L)溶液中,在-1.1~0.7 mV的电位窗口内以100 mV/s的扫描速率循环伏安扫描10周,用二次蒸馏水淋洗晾干,制备的电极称ZrO2/PMB/GCE。
取10 μL ssDNA(1.0×10-5mol/L)溶液滴涂到处理好的电极表面,在4 ℃的冰箱中保存12 h,依次用pH=7.0的PBS,水淋洗,去除多余的未固定ssDNA, 制备的电极称ssDNA/ZrO2/PMB/GCE。
1.3 实验方法
实验使用CHI660D电化学工作站记录电流响应信号。三电极系统分别是:以修饰电极为工作电极,SCE为参比电极,铂丝电极为辅助电极。支持电解质为PBS(0.1 mol/L,pH=7.0)。PMB的氧化峰电流在DNA杂交前后的变化ΔI作为DNA杂交检测信号:△I=IdsDNA-IssDNA
IdsDNA—杂交后PMB的氧化峰电流;IssDNA—杂交前的PMB的氧化峰电流。
2 结果与讨论
2.1 ZrO2/PMB/GCE的电化学表征
图1是不同电极在PBS(0.1 mol/L,pH=7.0)和Fe(CN)63-/4-(5 mmol/L)溶液中的电化学阻抗图(实验电压0.19 V)。裸GCE(a),PMB/GCE(b),ZrO2/PMB/GCE(c), ssDNA/ZrO2/PMB/GCE(d)。当MB聚合到裸玻碳电极表面时,电极呈现良好的导电性,电极阻抗图相当于一条直线(b)。当氧化锆电沉积到PMB修饰电极的表面时,电子传递阻力变大(c),这可能是由于ZrO2是半导体的缘故。当ssDNA组装到电极表面后,如图1(d)所示,其电阻传递阻力变大,这可能是因为DNA的磷酸基的负电和Fe(CN)63-/4-之间排斥作用的原因,表明修饰电极已经成功制备。
图1 不同电极的阻抗图Figure 1 Impedance plots for different electrodes.
2.2 扫描速率的影响
研究了扫描速率对ZrO2/PMB/GCE 的CV响应的影响,结果如图2所示。在50~350 mV/s扫描速率范围内,PMB的氧化峰的峰电流和还原峰的峰电流随扫速的增加,均呈良好的线性关系,它们的线性方程各自为i=1.029 6+3.508 6v,i=-1.877 4-3.020 0v,相关系数分别为R=0.990 2,R=0.991。表明该电极反应过程为吸附控制。
图2 扫描速率对ZrO2/PMB/GCE的CV响应的影响Figure 2 Effects of scan rates on the CV of ZrO2/PMB/GCE responses.
2.3 杂交温度的优化
DNA的杂交温度影响传感器的检测灵敏性,对DNA的杂交温度进行了优化。图3所示,随着温度的升高,△I不断增加,当超过50 ℃时,△I不再增强且有下降趋势。因此,实验选择50 ℃为最佳温度。
图3 杂交温度对△I的影响Figure 3 Effects of hybridization temperatures on △I.
2.4 杂交时间的优化
杂交时间的优化实验表明(图4):在杂交时间为5~20 min内,△I随着杂交时间的增加而增加。当杂交时间超过20 min时,△I不再增加而趋于稳定,说明DNA的杂交达到饱和。因此,在实验中20 min为最佳杂交时间。
图4 杂交温度对△I的影响Figure 4 Effects of hybridization times on △I.
2.5 传感器的选择性
图5是ssDNA/ZrO2/PMB/GCE与不同序列的目标DNA(10-6mol/L)杂交后的差分脉冲伏安图。由图5可知:当其与完全互补DNA序列杂交后峰电流变化最大(c),而与完全错配的DNA序列杂交时,峰电流基本没有变化。说明该传感器能够区分互补和错配的DNA序列。
图5 传感器与不同序列的目标DNA杂交后的差分脉冲伏安图Figure 5 The DPV plots for the sensors hybridized with different DNAs
2.6 传感器的线性范围
图6为△I与完全匹配DNA浓度对数之间的关系。对碱基完全互补但浓度不同的目标DNA进行杂交检测,实验结果显示:随着完全匹配DNA浓度的不断增加,而产生的峰电流依次减小。目标DNA的浓度(2.0×10-8、2.0×10-9、2.0×10-10、2.0×10-11、2.0×10-12mol/L)在2.0×10-12~2.0×10-8mol/L范围内,△I与完全互补DNA浓度的对数呈良好的线性关系。线性方程为ΔI=10.61+0.76 log[cDNA],相关系数R=0.9769,检测限约为4.1×10-13mol/L(S/N=3)。
2.7 传感器的稳定性、重现性和再生性
把修饰电极放在PBS(pH 7.0)中置于冰箱内保持4 ℃,分别放置不同时间(3、5、7 d)后,用于同浓度完全匹配的DNA检测,与新制备的传感器比较,检测信号分别为原来的92.4%,89.6%,86.8%。实验结果表明传感器的稳定性较好。同时制备4支传感器,进行完全匹配同浓度的DNA检测,相对标准偏差是4.5%,结果表明该传感器有好的重现性。把已经杂交的传感器放在浓氢氧化钠溶液中10 min后,依次用二次水、pH值为7.0的PBS淋洗后浸泡1 min,而后用于相同浓度完全匹配的DNA检测,连续4次,检测信号能保持为第1次的97.2%,92.5%,89.7%。实验结果表明所制备的传感器可以通过碱变性而实现再生。
2.8 样品测定
实验中把绿色蔬菜叶汁作为干扰物质研究所制备传感器的实际应用。取定量绿色蔬菜叶用二次蒸馏水清洗后,放入榨汁机中进行处理,取定量绿色蔬菜叶汁放在离心机中以10 000 r/min的速度离心5 min,取处理后的绿色蔬菜叶汁0.5 mL放在1.5 mL的杂交溶液中,加入完全匹配的目标DNA进行回收率实验,实验结果如表1。实验结果表明该传感器可以用于实际样品测定,具有较好的实际应用价值。
表1 样品分析结果
3 结论
本文研制了基于ZrO2/PMB/GCE的电化学DNA生物传感器,优化了实验条件,研究了传感器在转基因植物CaMV35S启动子基因检测中的应用。同时,制备的传感器具有较高的灵敏性,能够区分不同序列的DNA片段。此外,该传感器性能较为稳定,具有良好的选择性和再生性。其在DNA分析中具有潜在的应用价值。
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Preparation of Label-free Electrochemical CaMV35S Transgene Gene Sensor Based on ZrO2/Poly(methelene blue) Modified Electrode
ZHANG Na1, XU Jigui1*, TAN Shengfu1, WANG Li1, ZHANG Keying1, WANG Cong1, YANG Liuqing2
(1.DepartmentofChemistryChemicalEngineering,SuzhouUniversity,Suzhou,Anhui234000,China;2.DepartmentofPhysicalEducation,SuzhouUniversity,Suzhou,Anhui234000,China)
A ZrO2/poly(methelene blue) modified electrode was fabricated as a label-free DNA sensor used for CaMV35S transgene gene detection. Probe oligonucleotides (ssDNA) were immobilized on the ZrO2thin films via the strong affinity between ZrO2and phosphate groups. The changes of peak current of poly(methelene blue) were used as the detection signal.It was found that when the sensor hybridized with complementary target ssDNA, an obvious decrease of PMB oxidation peak currents was observed, whereas no obvious change of PMB oxidation peak currents was observed when the probe hybridized with non-complementary target ssDNA.For the completely complementary target ssDNA sequence, in the concentration range of 2.0×10-12—2.0×10-8mol/L,the change of peak current has a good linear relationship with the logarithm of the concentration of complementary target ssDNAwith thethe detection limit of 4.1×10-13mol/L (S/N=3).In addition, the sensor also exhibited an excellent stability, reproducibilityand repeatibility. Itwas applied to determine CaMV35S transgene gene sequencewith satisfactory results.
poly(methelene blue);ZrO2; DNA biosensor; label-free
10.3969/j.issn.2095-1035.2017.02.019
2016-10-08
2017-01-25
安徽省高校自然科学基金项目(KJ2017AA4341);宿州学院优秀青年人才支持项目(SZXYQNL2017001);宿州学院科研平台开放课题(2011YKF03,2015YKF16);国家大学生创新创业项目(201510379037);省级大学生创新创业训练项目(201510379051);宿州学院大学生科研立项(KYLXLKYB16-04)资助
张娜,女,讲师,主要从事电分析化学研究。
*通信作者:徐基贵,男,教授,主要从事化学研究。E-mail:szxyzn@163.com
O657.15;TH832.4
A
2095-1035(2017)02-0078-05
本文引用格式:张娜,徐基贵,谈胜福,等.氧化锆/聚亚甲基蓝修饰电极检测CaMV35S启动子基因[J].中国无机分析化学,2017,7(2):78-82.
ZHANG Na,XU Jigui, TAN Shengfu, et al. Preparation of Label-free Electrochemical CaMV35S Transgene Gene Sensor Based on ZrO2/poly(methelene blue) Modified Electrode[J].Chinese Journal of Inorganic Analytical Chemistry,2017,7(2):78-82.