截断逆挽方对慢加急性肝衰竭大鼠死亡受体途径的影响

穆凌云 李金霞 张秋云 陈煜 高连印 杜宇琼



截断逆挽方对慢加急性肝衰竭大鼠死亡受体途径的影响

穆凌云 李金霞 张秋云 陈煜 高连印 杜宇琼

目的 观察“截断逆挽方”对慢加急性肝衰竭大鼠JNK信号通路死亡受体途径的影响。方法 SPF级Wistar雄性大鼠70只，随机分为正常组、模型组、截断逆挽方组和SP600125组，各组大鼠给予猪血清腹腔注射13周，联合D氨基半乳糖/脂多糖(D-galactosamine/lipopolysaccharide,D-GalN/LPS)急性攻击，构建慢加急性肝衰竭大鼠模型，截断逆挽方组在急性攻击前给予截断逆挽方连续灌胃3天，SP600125组于急性攻击前半小时腹腔注射。各组大鼠均在急性攻击后4、8、12小时平行取材。用免疫组化法(Immunohistochemical detection,IHC)检测肝组织中半胱氨酸蛋白酶-8(Cysteine Proteinase-8,Caspase-8)、Caspase-3、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase ,Fas)的表达量，用蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测肝组织中Fas配体(Fas ligand,FasL)的表达量。结果 与正常组相比，模型组各时间点Caspase-3、Caspase-8、Fas、FasL表达增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，截断逆挽方组及SP600125组在4小时和8小时表达减少，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，12小时较模型组升高，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 截断逆挽方可以有效降低Caspase-3、Caspase-8、Fas、FasL的表达量，阻断死亡受体途径，减少模型大鼠肝细胞凋亡。

慢加急性肝衰竭； 截断逆挽方； 细胞凋亡； 死亡受体途径

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病的基础上，较短时间内发生急性或亚急性肝功能失代偿的临床症候群[1]。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是维持生物体内环境稳定和保证机体正常发育的主动死亡进程[2]，过度细胞凋亡可以导致肝组织细胞大量死亡，并破坏其生理结构及功能。作为参与细胞凋亡的重要信号传导途径之一，死亡受体途径的传导机制是细胞表面的死亡受体接受胞外信号，经由胞质内的死亡结构域(death domain，DD)进一步传递，介导细胞凋亡。本研究通过观察截断逆挽方对ACLF模型大鼠肝组织半胱氨酸蛋白酶-8(Cysteine proteinase-8，Caspase-8)、Caspase3、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,Fas)及Fas配体(Fas ligard,FasL)表达的影响，探讨该方对肝细胞凋亡的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar雄性大鼠70只，SPF级，体质量(180～200) g，购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，首都医科大学动物房SPF级饲养，每笼三只，不控制水食，室温18～23℃，湿度为(50.0±2.0)%，每隔12小时开灯照明。

1.2 主要试剂

猪血清(北京平睿生物有限公司，批号：20140713)；D-GalN(Inalco，批号：P29/14/221)；LPS(Sigma，批号：109K4075)；小鼠超敏二步法试剂盒(中杉金桥，批号：PV-9005)，兔二步法检测试剂盒(中杉金桥，批号：PV-9001)，DAB试剂盒(中杉金桥，批号：ZLI-9018)；Caspase-8 p18 antibody(Santa Cruz，批号：sc-5263)；Caspase-3(P12) antibody(普益华，批号：BA3968)；Anti-Fas antibody(Abcam,批号：ab82419)；Anti-Fas Ligand antibody(Abcam，批号：ab15285)；Beta-tubulin rabbit polyclonal antibody(Proteintech，批号：10094-1-AP)，Beta-actin rabbit polyclonal ntibody(CST，批号：4967S)；封闭用羊血清原液(中杉金桥，批号：ZLI-9021)；RegeRuler Prestained Protein Ladder(Fermentas，批号：26616)。

1.3 主要药物

截断逆挽方组成：苦味叶下珠30 g、瓜蒌30 g、金钱草30 g、生黄芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、莪术6 g、丹参20 g、生地黄20 g、黑附片15 g，药材购自北京同仁堂药店，浓煎，生药量为4.34 g/mL，4℃保存备用，使用前37℃水浴加热。

1.4 主要仪器

Eclipse 80i共聚焦荧光显微镜(Nikon)；Universal 320R低温离心机(Hettich)；1-14高速离心机(Sigma)；F6/10超细匀浆器(Fluko)；Model680酶标仪(Bio-Rad)；165-8003垂直电泳仪(Bio-Rad)；电泳电源(Bio-rad，Powerpac universal power supply 164-5070)；170-3930湿转电转仪(Bio-Rad)；Odysseey2.1红外荧光扫描成像系统(LI-COR)；EM-1400高衬度投射电子显微镜(JEOL)。

教育是未来的事业，儿童是民族的未来。教师要把一个不懂事的孩子培养成国家的栋梁，民族的脊梁，要付出毕生的精力。教师工作是平凡的，每天上课下课、备课、批改作业，为学生解惑排难；但教师的职业又是伟大的，教师要把儿童这个幼苗培育成参天大树。古人说：“十年树木，百年树人。”说明创造物质是比较容易的，塑造人、铸造人的精神是要经过几代人的努力。因此，教师要满怀对学生的真心关爱，以学生的发展为本，甘为人梯，乐于奉献，用心灵和汗水一点一滴地滋润学生的心田，把全部精力和满腔热情献给教育事业。

1.5 方法

1.5.1 大鼠模型的建立ACLF大鼠模型建立方法 (1)免疫阶段：Wistar雄性大鼠70只，随机分为正常对照组6只和处理组64只，处理组腹腔注射猪血清每次一只、一周两次注射0.5 mL，正常组大鼠注射等量生理盐水，共13周，造模过程中无死亡。于13周末随机抽取1只处理组大鼠处死，取肝组织做病理观察，根据《肝纤维化中西医结合诊疗指南》[3]判定免疫型肝纤维化造模是否成功。造模成功后，将处理组随机分为模型组、截断逆挽方组及SP600125组，各21只。(2)急性攻击阶段：模型组、截断逆挽方组及SP600125组同时给予D-GalN 800 mg/kg联合LPS 100 μg/kg腹腔注射造成急性攻击，建立ACLF模型。

1.5.2 分组与给药方法 急性攻击前，截断逆挽方组给予截断逆挽方浓缩液21.7 g/(kg·d)连续灌胃三天，正常组及模型组给予同等剂量生理盐水灌胃。各组大鼠分别于急性攻击4小时、8小时、12小时进行平行取材，每组每个时间点7只。大鼠麻醉后腹主动脉取血，摘取肝右叶同一部分置于10%福尔马林溶液固定，余下部分于液氮中快速冻存。

1.5.3 IHC法检测肝组织中Caspase-3、Caspase-8、Fas蛋白的表达 10%福尔马林固定肝组织后进行石蜡包埋、切片，常规脱蜡、水化，微波抗原修复，10%正常羊血清封闭1小时，Caspase-3多克隆抗体(1∶50)、Caspase-8多克隆抗体(1∶200)、Fas多克隆抗体(1∶50)4℃过夜孵育，PBS洗涤后滴加HRP标记二抗37℃孵育1小时，Caspase-3、Caspase-8、FasDAB分别显色2分钟、4分钟、90秒，苏木素复染。每组每个时间点观察三张切片，随机选取10个高倍视野进行拍摄，并运用NIKON NIS-Elements BR软件进行阳性表达的标示及积分光密度值(IOD)检测。

1.5.4 WB法检测肝组织中FasL蛋白的表达 取出冻存肝组织样品，在冰上操作，每组每个时间点取5支进行匀浆、蛋白定量，按照蛋白定量试剂盒说明书步骤测定蛋白浓度。每支上样蛋白84 μg，经10%SDS-聚丙烯凝胶电泳分离后300 mA电转1小时至0.22 μm NC膜上，5%脱脂奶粉封闭1小时，FasL抗体(1∶500)4℃孵育过夜，TBST洗涤，加山羊抗兔二抗(1∶5000)室温孵育1小时，红外荧光扫描成像系统Oddsey扫膜。以β-actin作为参照蛋白，使用ImageJ2x软件获得目的蛋白条带的灰度值，通过灰度比较的方法来确定目的蛋白相对于内参的表达量，以分析样本之间目的蛋白表达量差异。

1.6 统计学处理

2 结果

Caspase-3被染成棕褐色，在细胞质表达。与正常组相比，模型组各时间点表达增多，4小时 Caspase-3表达明显增多，随着时间延长逐渐增多，8小时达到高峰，12小时较前减少，经LSD检验差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，在4、8小时截断逆挽方组及SP600125组Caspase-3蛋白表达明显降低，经LSD检验差异具有统计学意义(P<0.05)，而12小时其表达经LSD检验无统计学意义(P>0.05); 同时Caspase-3蛋白表达减少，证明截断逆挽方可以有效减慢细胞凋亡的进程，抑制蛋白表达，减少肝细胞凋亡，其作用机制与JNK抑制剂SP600125相似。详见表1、图1。

表1 各组大鼠Caspase-3表达IOD值比较

注： 与正常组比较，aP<0.05，与对应时间点模型组比较，bP<0.05，cP<0.01；与同一处理组前一时间点比较，dP<0.01。

注：A.正常组；B.截断逆挽方4小时组；C.模型4小时组； D.SP600125 4小时组；E.截断逆挽方8小时组； F.模型8小时组；G.SP600125 8小时组；H.截断逆挽方12小时组； I.模型12小时组；J.SP600125 12小时组

图1 免疫组化法检测大鼠肝组织Caspase-3蛋白表达(×200)

2.2 截断逆挽方对 ACLF 大鼠肝组织Caspase-8蛋白表达的影响

Caspase-8被染成棕褐色，在细胞核表达。与正常组相比，模型组4小时Caspase-8表达明显增多，随着时间延长表达逐渐增多，至8小时达到高峰，12小时表达则较前减少，经LSD检验具有统计学明显差异(P<0.01)；与4、8小时模型组相比，截断逆挽方组及SP600125组Caspase-8蛋白表达明显降低，经Tamhane’s T2检验差异具有统计学意义(P<0.05)，至12小时表达略高，整体趋势随着时间的推移而逐渐升高。提示截断逆挽方可以抑制Caspase-8的表达，其作用同JNK抑制剂SP600125相似。详见表2、图2。

表2 各组大鼠Caspase-8表达IOD值比较

注：与同一时间点模型组比较，aP<0.01；与同一时间点正常组比较，bP<0.05、cP<0.01；与同一处理组上一时间点比较，dP<0.01。

注：A.正常组；B.截断逆挽方4小时组；C.模型4小时组； D.SP600125 4小时组；E.截断逆挽方8小时组； F.模型8小时组；G.SP600125 8小时组；H.截断逆挽方12小时组；I.模型12小时组；J.SP60012512小时组

图2 免疫组化法检测大鼠肝组织Caspase-8蛋白表达(×200)

注：A.正常组；B.截断逆挽方4小时组；C.模型4小时组；D.SP600125 4小时组；E.截断逆挽方8小时组；F.模型8小时组； G.SP600125 8小时组；H.截断逆挽方12小时组；I.模型12小时组；J.SP600125 12小时组

图3 免疫组化法检测大鼠肝组织Fas蛋白表达(×200)

2.3 截断逆挽方对ACLF大鼠肝组织Fas蛋白表达的影响

Fas蛋白被染成棕褐色，在细胞核表达。与正常组相比，模型组4小时Fas表达明显增多，且随着时间的延长其表达逐渐增多，至8小时达到高峰，12小时表达则较前减少，经LSD检验差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，在4、8小时截断逆挽方组及SP600125组Fas蛋白表达明显降低，经LSD检验差异具有统计学意义(P<0.01)，而至12小时其表达则略高于模型组，其表达随着时间的推移呈现逐渐升高的趋势。结果提示截断逆挽方及SP600125可以有效抑制FasL蛋白的表达，减少肝细胞凋亡，与SP600125作用大致相似。详见表3、图3。

表3 各组大鼠Fas表达IOD值比较

注：与同一时间点模型组比较，aP<0.01；与同一时间点正常组比较，bP<0.05、cP<0.01；与同一处理组上一时间点比较，dP<0.05。

2.4 截断逆挽方对ACLF大鼠肝组织FasL蛋白表达的影响

与正常组相比，模型组4小时FasL蛋白表达增多，至8小时达到高峰，12小时表达减少，经LSD检验具有显著统计学差异(P<0.01)；截断逆挽方组4、8小时FasL蛋白表达较模型组少，而12小时表达较多，整体呈现逐渐升高的趋势。与模型组相比，SP600125组4小时(P<0.05)、8小时(P<0.01)FasL蛋白表达较少，经LSD检验差异具有统计学意义，而12小时(P>0.05)经Tamhane’s T2检验差异具有统计学意义，蛋白呈持续增高表达。结果提示截断逆挽方可以有效抑制FasL蛋白的表达，减少肝细胞凋亡，作用机制与SP600125大致相似。

注：A.SP600125 12小时组； B.模型12小时组； C.截断逆挽方12小时组；D.SP600125 8小时组；E.模型8小时组；F.截断逆挽方8小时组；G.P600125 4小时组；H.模型4小时组； I.截断逆挽方4小时组；J.正常组

图4 Western Blot法检测各组大鼠肝组织FasL蛋白表达情况

表4 各组大鼠FasL表达IOD值比较

注：与同一时间点模型组比较，aP<0.01；与同一时间点正常组比较，bP<0.05、cP<0.01；与同一处理组上一时间点比较,dP<0.01。

3 讨论

ACLF可在短期内出现较高死亡率，28天内死亡率可高达15%[4]，临床多采用内科常规治疗、人工肝及肝移植等措施，但治疗效果均不理想。近些年来，中医药对ACLF的干预研究在临床实践和基础研究方面均取得了很大进展，为中医药参与治疗并不断提高疗效奠定了良好的基础。JNK抑制剂SP600125可以对JNK信号通路产生特异性地抑制作用，目前已有相关动物实验证实SP600125可以直接抑制c-Jun磷酸化并且在一定程度上干预治疗动物疾病模型[5-6]。据此，有望为中医药临床治疗ACLF提供新的分子作用靶点。

笔者课题组前期实验研究结果表明[7-9]：截断逆挽方可改善肝细胞超微结构损伤、降低ACLF大鼠死亡率；也可以降低血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、白细胞介素1β、白细胞介素6及肝组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子受体(TNFR1)的含量，即可通过阻断TNF-α/TNFR1途径减轻肝细胞凋亡。肝细胞凋亡主要通过两种途径介导：线粒体途径和死亡受体途径。且李金霞等[10]已证实截断逆挽方可以减轻肝细胞超微结构损伤程度以及抑制Bid、CytC蛋白的表达，与阻断线粒体途径有关。死亡受体途径又称外源性凋亡途径，由胞外信号诱导细胞凋亡，凋亡介导的通路主要有三条[11]：Fas/FasL途径、TNFR途径、TRAIL途径。死亡受体属于TNFR超家族，已知存在于哺乳动物细胞表面的至少有8种：TNFR1、TNFR2、Fas、DR3、DR4、DR5、DcR1和DcR2[12]。Fas/FasL诱导细胞凋亡是细胞表面的Fas蛋白被激活后，启动了Fas配体FasL的表达，FasL与Fas结合后，诱导Fas胞内的死亡区形成三聚体并活化，然后募集胞浆内Fas相关死亡结构域蛋白，形成并激活死亡信号复合物[13]，引起Caspase-8激活，启动下游Caspase蛋白级联反应，诱导细胞凋亡。此外，Caspase-8还可以激活Bid、Bax等Bcl-2家族蛋白，促进Cytc释放，通过线粒体途径诱导细胞凋亡。吴文秀等[14]证实截断逆挽方可以有效降低肝细胞Caspase-3、Caspase-8表达量，减轻肝细胞凋亡和坏死。

本实验中，与正常组相比，模型组在4～8小时Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8表达均呈现逐渐升高趋势，提示Fas与FasL结合，并激活下游Caspase-3、Caspase-8蛋白发生级联反应，高峰出现在急性攻击后8小时。12小时Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8表达均较8小时降低，但仍高于正常组，这可能与8～12小时肝细胞发生大量死亡有关，此时细胞凋亡活动减少。截断逆挽方组及SP600125组在4小时、8小时时Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8表达量均较模型组减少，4～12小时呈现持续升高表达。以上结果表明截断逆挽方及SP600125可以在4、8小时有效减少Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8的表达。但12小时模型组蛋白表达减少，而给药组表达量却持续增多，提示ACLF大鼠急性攻击后可能出现肝细胞大量死亡，凋亡活动减少。

上述结果提示截断逆挽方可以有效降低ACLF大鼠肝组织蛋白Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8的含量，抑制死亡受体信号途径上关键蛋白表达，其作用机制与JNK抑制剂SP600125相似。

综上分析，降低肝组织蛋白Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8表达，干预JNK信号通路相关死亡受体途径从而减少肝细胞凋亡，可能是截断逆挽方减轻ACLF模型大鼠肝细胞损伤的部分作用机制。

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(本文编辑： 王馨瑶)

Effect ofJieDuanNiWanprescription on death receptor pathway in acute-on-chronic liver failure rat model

MUlingyun,LIjinxia,ZHANGqiuyun,etal.

CapitalMedicalUniversitySchoolofTraditionalChineseMedicine&BeijingKeylaboratoryofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch,Beijing100069,China

ZHANGqiuyun,E-mail:zhangqiuyun8202@aliyun.com

Objective To observe the effect ofJieduanNiwan(JDNW) on the death receptor pathway of JNK signaling pathways in acute-on-chronic liver failure (ACLF) rats, and study its mechanism. Methods 70 SPF male Wistar rats were randomly divided into normal group, model group,Jieduan-Niwanprescription group and JNK inhibitor SP600125 group. Except normal group, other groups were given intraperitoneal injection with porcine serum for 13 weeks combined with D-galactosamine / lipopolysaccharide (D-GalN/LPS) acute attack to induce the model of ACLF,JDNWgroup intragastric administration for 3 days before acute attack, SP600125 group was intraperitoneal injection half an hour before acute attack. The rats were sacrificed in 4,8,12h after acute attack. Caspase-3, Caspase-8, Fas in liver tissue was detected by immunohistochemical method, the expression of FasL in liver tissue was detected by Western Blot. Results Compared with normal group, the expression of Caspase-3, Caspase-8, Fas, FasL were increased(P< 0.05) in model group at different time points; compared with the model group,JDNWgroup and SP600125 group was reduced at 4h and 8h(P<0.01 orP<0.05), while that was higher than model group at 12h, result had not statistically significant (P>0.05). BothJDNWgroup and SP600125 group can reduce the expression of Caspase-3, Caspase-8, Fas, FasL, and the mechanism was similar. Conclusion The prescription ofJieduan-Niwancan effectively reduce the expression of Caspase-3, caspase-8, Fas, FasL, the mechanism may be related to blocking the death receptor pathway of JNK signaling pathway.

Acute-on-Chronic Liver Failure;JieduanNiwanformula; Apoptosis; Death receptor pathways

首都中医药研究专项(14ZY01)

100069 北京, 首都医科大学中医药学院[ 穆凌云(硕士研究生) 、李金霞(硕士研究生)、张秋云、高连印、杜宇琼] ; 中医络病研究北京市重点实验室[ 穆凌云( 硕士研究生) 、张秋云、高连印、杜宇琼]；首都医科大学附属佑安医院人工肝中心(陈煜)

穆凌云(1992- )，女，2014级在读硕士研究生。研究方向：中医药防治肝胆证治规律。E-mail：mumu920308@163.com

张秋云(1962- )，女，博士，教授，博士生导师。研究方向：中医内科肝病。E-mail: zhangqiuyun8202@aliyun.com

R259

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.007

2016-12-17)