绿僵菌菌剂培养及田间生物防治研究

摘 要：绿僵菌作为重要的生物农药制剂，研究及应用非常广泛。本研究通过试验探索了固体培养绿僵菌L8500-2x菌株的最佳培养基配方及工艺条件，进行了田间试验示范推广，为有效利用绿僵菌进行田间合理的防治提供了科学参考。

关键词：绿僵菌；菌剂培养；生物防治

中图分类号：S476.1 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170533028

绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是重要的昆虫病原真菌之一[1]，将其作为主要生物活性成分的制剂，具有不污染环境、无残留、易生产、致病力强、持效期长、应用效果好、对非靶标生物安全等优点，其寄主范围广，可在8目30科200余种农林害虫上寄生，其应用前景非常广阔[2，3]。近年来，由于化学农药的大量使用，食品安全和健康问题、环境保护问题倍受重视，生物农药的研发及推广具有深刻意义[4]。

目前，绿僵菌生物农药的生产普遍采用液固双相发酵工艺，其固体载体多为大米和稻壳，国外绿僵菌生产的固体载体多为稻米[5]。绿僵菌制剂的剂型主要有粉剂、可湿性粉剂等，其助剂的成分和配比是当前研究热点。本研究为了大量生产绿僵菌菌剂用于田间农作物害虫的防治，先采用液体发酵培养绿僵菌L8500-2x菌剂，再采用固体发酵培养绿僵菌L8500-2x菌粉，进行田间试验示范推广，可为有效利用绿僵菌防治农作物病害提供参考，为适应绿色农业的发展要求，减少高毒、高残留化学农药的使用提供科学方法。

1 试验材料与方法

1.1 绿僵菌L8500-2x菌株固体发酵培养载体的筛选

1.1.1 试验材料

绿僵菌培养载体：麦麸、硅藻土、磷酸钙、锯末、谷糠、玉米粉；试验害虫是菜青虫2代幼虫。

1.1.2 试验方法[6]

利用麦麸、硅藻土、磷酸钙、锯末、谷糠、玉米粉等廉价物质作为基质进行绿僵菌L8500菌剂的生产，观察不同供试载体对绿僵菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发率的影响，经对比试验，确定固体培养绿僵菌L8500-2x菌种的最佳培养基配方及工艺条件[7]。

1.2 绿僵菌L8500-2x菌剂田间生物防治试验

1.2.1 绿僵菌L8500-2x菌剂防治

马铃薯28星瓢虫药效试验。

1.2.1.1 供试药剂

绿僵菌L8500-2x菌剂13.5L（山西省医药与生命科学研究院提供）、清水。

1.2.1.2 防治对象

马铃薯28星瓢虫第1代幼虫。

1.2.1.3 试验点基本情况

试验点设在山西静乐县王村乡善应村，属黄土丘陵区，马铃薯品种为紫花白。

1.2.1.4 试验时间

2009年7月10日，这个时期是第1代幼虫为害盛期。

1.2.1.5 试验处理

试验设绿僵菌（L8500-2x）10倍菌剂、20倍菌剂及清水对照共3个处理。试验每处理重复3次，共9个小区，小区随机组排列，小区面积667m2，试验面积共6003m2。

1.2.1.6 试验方法

将绿僵菌（L8500-2x）菌剂稀释10倍、20倍，用手动喷雾器均匀喷雾，药液用量为30L/667m2（稀释后）。

1.2.1.7 调查记录和计算方法[8]

认真调查药后1d、3d、5d、7d各处理小区的残存数量（头/百株），调查采用对角线5点取样法，每点查100株，算出平均数，并详细记录。计算防效，其公式为：

1.2.2 绿僵菌L8500-2x菌剂防治土蝗田间药效试验

1.2.2.1 供试药剂

绿僵菌（L8500-2x）菌剂（山西省医药与生命科学研究院提供）40.5L、清水。

1.2.2.2 防治对象

蝗蝻（1～2龄）。

1.2.2.3 试验点基本情况

试验点设在静乐县段家寨乡永安镇村草滩，该地区是土黄重发区。

1.2.2.4 试验时间

2009年6月25日，这时蝗蝻大部分为1～2龄。

1.2.2.5 试验处理

试验共设3个大区，每个试验大区设绿僵菌L8500-2x菌剂10倍、20倍稀释液及清水对照共3个处理。每处理重复3次，共9个小区，小区随机组排列，小区面积667m2。该实验共27个小区，面积18009 m2。

1.2.2.6 试验方法[9]

小区提前10d用纱网围严实，保证小区内蝗蝻不迁移。将L8500菌剂按10倍、20倍稀释后，用手动喷雾器对各处理小区均匀喷雾防治，药液用量为30L/667m2（稀释后）。

1.2.2.7 调查记录和计算方法

调查药后3d、5d、7d各处理小区的虫口密度，并详细记录在表，计算防效，其公式为：

防效=×100%

1.2.3 固体培养绿僵菌L8500-2x菌粉防治土蝗田间试验

1.2.3.1 供试药剂

固体培养的绿僵菌L8500-2x菌粉（山西省医药与生命科学研究院提供）9kg、菌液9L及清水。

1.2.3.2 防治對象

蝗蝻（1～2龄）。

1.2.3.3 试验点基本情况

试验点设在静乐县段家寨乡永安镇村草滩，该地区是土黄重发区。

1.2.3.4 试验时间

2010年7月5日。

1.2.3.5 试验处理

试验共设绿僵菌L8500-2x菌剂10倍稀释液、固体培养L8500菌粉10倍稀释液及清水对照共3个处理。每处理重复3次，共9个小区，小区随机组排列，小区面积667m2，面积6003m2。

1.2.3.6 试验方法

小区提前10d用纱网围严实，保证小区内蝗蝻不迁移。将菌液10倍稀释，药液用量为30L/667m2（稀释后）；L8500-2x菌粉用水10倍稀释，药粉用量为3kg/667m2，用手动喷雾器对各处理小区均匀喷雾防治。

1.2.3.7 調查记录和计算方法

调查药后3d、5d、7d各处理小区的虫口密度（头/m2），并详细记录在表，计算防效，其公式为：

防效=×100%

2 试验结果与分析

2.1 绿僵菌L8500-2x菌株固体发酵培养载体的筛选结果与分析

表1实验结果可以看出，供试载体对绿僵菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发率都有影响，以硅藻土+谷糠+玉米粉对孢子活力保护最好，其次为硅藻土、碳酸钙、高岭土+稻壳+玉米粉，与对照相比其孢子萌发率、产孢量差异显著。

以硅藻土+谷糠+玉米粉、高岭土+稻壳+玉米粉2组供试载体为基础，选出3种固体培养绿僵菌L8500菌种的培养基配方，经对比试验，确定了固体培养绿僵菌L8500-2x菌种的最佳培养基配方及工艺条件。

培养基配比1：葡萄糖1%，硅藻土40%，谷糠25%，玉米粉15%，加水19%，装袋中。

培养基配比2：葡萄糖1%，高岭土40%，稻壳25%，玉米粉15%，加水19%，装袋中。

培养基配比3：葡萄糖1%，硅藻土45%，谷糠15%，麦麸10%，玉米粉10%，加水19%，装袋中。

经方差分析，试验处理组间存在差异不显著P >0.05。但从应用效果及成本综合考虑，选用培养基配比三既经济又合理，且防效率达到80.4%。

经对比试验，确定了固体培养绿僵菌L8500-2x菌株的最佳培养基配方及工艺条件。培养基配比：葡萄糖1%，硅藻土45%，谷糠15%，麦麸10%，玉米粉10%，加水19%，装袋中。温度121℃，灭菌30min后，冷却，用液体菌种L8500-2x接种，然后26～28℃培养10～15d，与等量已灭好菌的固体培养基混合，过筛备用，稀释后田间喷撒。

2.2 绿僵菌L8500-2x菌剂田间生物防治试验结果与分析

2.2.1 绿僵菌L8500-2x菌剂防治马铃薯28星瓢虫药效试验结果与分析

根据计算结果（表3）绿僵菌L8500-2x菌剂10倍稀释液、20倍稀释液防治马铃薯28星瓢虫一代幼虫效果均明显，7d后防效分别达82.4%、78%，在实际应用中，考虑到经济成本核算，选绿僵菌菌剂20倍稀释液用于大田试验示范推广应用。

2.2.2 绿僵菌L8500-2x菌剂防治土蝗田间药效试验结果与分析

根据计算结果（表4-6），绿僵菌L8500-2x菌剂10倍液3个区平均防效达80%、20倍液3个区平均防效达75%，其中10倍液防治率最高达81%，2个处理防治蝗蝻（1～2龄）效果均显著，达到了土蝗的防控目标，建议防治低龄蝗蝻用20倍菌液，防治大龄爆发性土蝗用10倍菌液。

2.2.3 固体培养绿僵菌L8500-2x菌粉防治土蝗田间试验结果与分析

结果表明，液体培养绿僵菌L8500-2x菌剂防治蝗虫效果比固体培养L8500-2x菌粉的防治效果要高，但菌液不好保存，固体发酵菌粉好保存，防治效果也明显。所以绿僵菌生物农药的生产目前普遍采用液固双相发酵工艺。

3 试验结论与讨论

通过本研究探索了固体培养绿僵菌L8500-2x菌株的最佳培养基配方及工艺条件，进行了田间试验示范推广，为有效利用绿僵菌合理防治防治马铃薯28星瓢虫及防治田间蝗蝻（1～2龄）提供科学参考。

生物农药代替化学农药的呼声日益高涨[10]、其利好也不言而喻，但是目前一些国家的生物农药产量已经达到10%，而我国产量仅为1%。所以加大对生物农药科学规范的研究、对防治效果提供科学的数据资料，才能为生物农药的推广和宣传创建有力保障[11]。

参考文献

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[2]张礼生，张泽华，高松，等.绿僵菌生物农药的研制与应用[J]. 中国生物防治，2006，22（s）：141-146.

[3]Loera-Corral O，Porcayo-Loza J，Montesinos-Matias R， et al.Production of Conidia by the Fungus Metarhizium anisopliae Using Solid-State Fermentation[J]. Microbial-Based Biopesticides：Methods and Protocols，2016：61-69.

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[7]洪军，林峻，杜桂林，等.牧鸡对草原蝗虫防控能力与经济效益研究[J].植物保护，2014，40（06）：185-188.

[8]马丽娟.优良绿僵菌菌株的筛选及应用性研究[D].保定：河北农业大学：2012：1-61.

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[11]郝东川，梁彪，谭德龙，等.生物农药的使用技术及注意事项[J].农业与技术，2015，35（14）：10.

作者简介：杨文彬（1964-），山西省医药与生命科学研究院高级工程师，研究方向：毒理学及药效学研究。