铁观音黄片和茶末体外抗人乳腺癌作用研究

林 玲，黄杰荣，鲁 静，张鲁榕，林金科，*

（1.福建农林大学园艺学院，福建福州350002；2.福建农林大学安溪茶学院，福建泉州362000；3.福建省临床医学实验平台；4.福建省个体化主动免疫治疗重点实验室；5.福建省放射生物福建省高校重点实验室，福建福州350005）

铁观音黄片和茶末体外抗人乳腺癌作用研究

林 玲1，黄杰荣1，鲁 静2，张鲁榕3，4，5，林金科1，2*

（1.福建农林大学园艺学院，福建福州350002；2.福建农林大学安溪茶学院，福建泉州362000；3.福建省临床医学实验平台；4.福建省个体化主动免疫治疗重点实验室；5.福建省放射生物福建省高校重点实验室，福建福州350005）

本文研究铁观音黄片和茶末体外抗人乳腺癌MDA-MB-468细胞的作用。以铁观音按照1:25的茶水比进行浸提30min的茶汤为原始浓度的试验样品，利用MTT法测定人乳腺癌细胞增殖抑制率，流式细胞术检测细胞凋亡比例并进行凋亡相关蛋白的检测。结果表明：铁观音黄片和茶末均能抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞的增殖，其干预MDA-MB-468细胞48h的IC50分别为终浓度稀释119.87±12.22倍和117.56±21.73倍。用其IC50浓度进行诱导细胞凋亡试验，表明了该两种品类铁观音副产品均能显著提高MDA-MB-468细胞的凋亡比例，且这两种铁观音副产品均是通过促进Caspase 9和Caspase 3蛋白的活化来诱导细胞凋亡的。

铁观音；乳腺癌；细胞凋亡；作用机制

乳腺癌是当今世界癌症死亡率较高的疾病，是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率已位居女性恶性肿瘤的首位[1]。目前其治疗手段主要以外科手术为主的综合治疗，并辅以化疗药物。但由于化疗药物的毒副作用、耐药性等因素，严重影响化疗的疗效，并在一定程度上降低了患者生存质量[2]。近年来，对茶叶保健功效的研究如火如荼，其抗癌作用也是研究的热点之一。茶叶中的EGCG、茶多酚和茶氨酸等多种成分都被报道具有良好的抗癌作用[3-7]。但以茶汤作为研究对象的报道确极少见。铁观音茶是中国的十大名茶之一[8-11]，其在福建茶产业中占有重要地位，但其在抗乳腺癌的作用方面尚未明确。所以本文选取了铁观音产业链中两种副产品，黄片和茶末，探索其对乳腺癌MDAMB-468细胞的作用，为铁观音副产品综合利用、拓宽茶叶在抗癌方面的功效研究提供参考价值。

1 实验材料与方法

1.1 材料

铁观音黄片和茶末由安溪县桃源有机茶场有限公司提供。

MDA-MB-468细胞株购于中国科学院上海细胞所。

试剂：胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培养基、青链霉素溶液、胰蛋白酶、（美国Hyclone公司），RIPA裂解液、Marker、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），兔抗人β-actin蛋白多克隆抗体、兔抗人Caspase 3蛋白多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），鼠抗人Caspase 9蛋白多克隆抗体（英国Rab MAb公司），MTT（北京索莱宝科技有限公司）。

仪器：倒置相差显微镜（日本Olympus），台式冷冻离心机（美国Beckman），CO2培养箱（美国Thermo），化学发光成像系统（美国Protein Simple），酶标仪（美国Thermo），生物洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），-70℃低温冰箱（日本SANYO）。

1.2 方法

铁观音黄片和茶末按1:25的茶叶重量与水体积比，用沸水在98℃的水浴锅中浸提30min，滤纸过滤、冷却后，用0.22um的过滤器进行过滤除菌、分装，-20℃保存，即为相应的铁观音黄片和茶末原浓度试验样品。

细胞培养：人乳腺癌MDA-MB-468细胞使用含10%胎牛血清、青霉素与链霉素各l00U/ml的DMEM高糖培养液培养，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞生长至70%～80%后，用0.25%的胰酶消化传代[12]。

MTT法检测细胞增殖：取生长状态良好的对数生长期MDA-MB-468细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为2×104个/ml，利用排枪每孔接种150ul于96孔板中。置于37℃，5%CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁后加入50ul用完全培养液稀释的茶汤试验样品。置于培养箱培养48h后，小心弃去原培养液，每孔加入含有10%MTT（5mg/ml）的完全培养液200ul恒温培养箱染色4h后，小心吸取上清液，每孔加入150ul DMSO，充分振荡10min后，用酶标仪在490nm处测定各孔的吸光度（OD值），计算细胞增殖抑制率[13]。

事先对待试验茶汤用完全培养液进行稀释，使得干预终浓度为原试验茶汤浓度的10，50，100，150，200，250，300倍。各组实验设置3个平行孔，实验重复3次。

按照细胞增殖抑制率（%）=(1—实验孔OD值/对照孔OD值)×100%，计算各组实验的细胞增殖抑制率，并通过SPSS计算出各组实验IC50所对应的相应终浓度稀释倍数，进行后续实验。

2.3.2 使用时效。在水产养殖之前，需要定期投放微生物制剂，尽可能将环境污染因子所造成的影响降至最低。同时使用越早，成效越显著。在水产养殖后期，水体质量相对较差，影响微生物的生长，若在此时才开始运用，在短期内难以实现预期目标。根据相关资料可知，需要定期应用微生物制剂以保持平稳的水色与菌藻均衡，在养殖初期需要每周使用1次，后期为了提升水体的透明度，需要每周使用2次，持续使用两三次。

流式细胞术检测细胞凋亡：取生长状态良好的对数生长期MDA-MB-468细胞，制成悬液，调整细胞密度为4.5×105个/ml，在6孔板中每孔加入1ml的细胞悬液。置于培养箱中培养，待细胞贴壁后按照各组MTT中计算的IC50浓度，加入各试验组预先用完全培养液稀释后的茶汤25ul，置于培养箱中培养48h后，用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，采用Annexin V-FITC法，根据细胞凋亡检测试剂盒说明进行操作，用流式细胞仪进行上机检测[14]。实验重复3次。

Western blotting检测凋亡相关蛋白试验：提取细胞总蛋白：收集各组茶汤IC50浓度下干预48h的各组细胞，蛋白裂解液于冰上裂解细胞30min后，于4℃，12000rpm离心机上离心5min，取上清液，用BCA法测定总蛋白浓度，并用裂解液稀释成相同浓度，加入蛋白上样缓冲液，充分混匀，沸水浴5min后-20℃保存，待测[15-17]。

取待测蛋白，进行电泳1.5h，转膜1h，将蛋白转至PVDF膜上，TBST洗膜2次，5%脱脂奶粉封闭1h，TBST洗膜3次，一抗孵育1h或者4℃冰箱过夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1h，TBST洗膜3次，加入发光液进行显影[15]。

图像分析，使用Image-J软件和Excel软件进行光密度值分析。蛋白相对表达量=蛋白条带密度/相应β-actin条带密度。

1.3 统计分析

实验结果数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析，实验数据均采用平均值加减标准差（±s）来表示。

2 结果与分析

铁观音黄片和茶末对MDA-MB-468细胞增殖抑制率的影响均有其稀释倍数呈负相关关系，即与茶叶干预浓度呈正相关关系。茶叶浓度越高，对细胞的增殖抑制越明显。详见表1。通过SPSS计算茶叶干预MDA-MB-468细胞48h时，其IC50对应的茶汤稀释浓度分别为：黄片组119.87±12.22倍，茶末组117.56±21.73。铁观音黄片和茶末的IC50浓度没有明显差距，说明了2种铁观音副产品对乳腺癌细胞MDA-MB-468的干预效果相当。

2.2 铁观音黄片和茶末对乳腺癌细胞凋亡的影响

正常组MDA-MB-468细胞凋亡比例为3.18±0.41%，与正常组对比，黄片组和茶末组的细胞凋亡比例均显著增加（P<0.05），分别为18.55±2.08%和19.73±3.09。详见表2，图1。可见铁观音黄片和茶末诱导乳腺癌细胞MDAMB-468凋亡的效果相当。

2.3 铁观音黄片和茶末对细胞凋亡相关蛋白表达的影响

从图2和图3可以看出，铁观音黄片和茶末均能显著提高乳腺癌细胞MDA-MB-468凋亡相关蛋白Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9的表达水平（P<0.05）。在Cleaved-caspase3蛋白表达水平上，黄片组和茶末组的相对表达水平都提高了2倍以上的。在Cleaved-caspase 9蛋白表达水平上，黄片组提高了84%，茶末组提高了143%。但对Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9两个蛋白表达水平的促进上，茶末组均比黄片组作用更强。

表1 铁观音黄片和茶末对MDA-MB-468细胞增殖抑制率的影响（%）

表2 铁观音黄片和茶末对MDA-MB-468细胞凋亡的影响（48h，±s）

表2 铁观音黄片和茶末对MDA-MB-468细胞凋亡的影响（48h，±s）

??? ??? ??? ???%? 3.18–0.41 18.55–2.08* 19.73–3.09*

图1 不同铁观音茶对MDA-MB-468细胞凋亡的影响

图2 铁观音黄片和茶末对MDA-MB-468细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

图3 铁观音黄片和茶末对MDA-MB-468细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

3 讨论

在本研究中，铁观音黄片和茶末均能有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-468的增殖，且均通过诱导细胞凋亡，影响乳腺癌细胞的正常增殖。该结果与前人研究茶叶或茶叶单体的抗癌作用结果一致。尚泽森，马丽清等[18]研究表明可通过利用EGCG抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的周期进程，抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。易香华[19]研究普洱茶抑制乳腺癌SHZ-88细胞及保护亚基肌诱导的胃癌前病变和放疗损伤的作用，其MTT结果显示普洱茶呈时间和剂量依赖性显著抑制SHZ-88细胞的增殖，流式细胞术结果表明普洱茶能显著促进SHZ-88细胞的凋亡和坏死。综上都表明了茶叶能够诱导乳腺癌细胞凋亡，有效抑制乳腺癌细胞的增殖作用。

Caspase家族在细胞凋亡的启动和执行阶段发挥着重要作用，其可分为凋亡起始者（如caspases2,8,9,10）和凋亡执行者（caspases3,6,7）[20-22]。Caspase 9是内源凋亡通路的凋亡启动起始者，激活Caspase 9进而触发Caspase级联反应，活化的Caspase 9即Cleaved-caspase 9对下游的凋亡执行者Caspase 3进行活化和切割，活化的Caspase 3即Cleaved-caspase 3以细胞内的重要蛋白作为靶点，进行水解裂解，导致了细胞程序性死亡。本研究中，铁观音黄片和茶末均能促进提高细胞Caspase 9的活化水平，进而发生Caspase级联反应，刺激信号通路下游Caspase 3的活化，最终促使乳腺癌MDA-MB-468细胞的凋亡。该结果与前人研究茶叶单体对Caspase 3和Caspase 9的作用结果一致。王旭，强兆艳等[23]研究塞来昔布与茶多酚合用对乳腺癌细胞细胞增殖及凋亡的影响，结果表明塞来昔布和茶多酚单用及合用均能上调Bax、Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白的表达，两药合用具有协同作用。徐泽平[24]探讨茶多酚诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用机理，结果表明随着茶多酚浓度的提高，Caspase 3活力逐渐升高，具有时间—剂量依赖性，说明茶多酚可以诱导MCF-7细胞Caspase 3活化。

通过对铁观音黄片和茶末体外抗人乳腺癌细胞的效果和机理的研究，为茶叶在保健功效中的疗效提供了理论依据，同时为更好地研究茶叶在体内的作用功效提供了研究方向和参考价值。

[1]方琼英,吴琼,张秀玲等.乳腺癌的流行现状分析[J].中国社会医学杂志,2012,29(5):333-335.

[2]Hulka BS,Moorman PG.Breast cancer:hormones and other risk factors [J].Maturitas,2001,(38):103-113.

[3]Thangapazham R L,Passi N,Maheshwari R K.Green tea polyphenol and epigallocatechin gallate induce apoptosis and inhibit invasion in human breast cancer cells[J].Cancer biology&therapy,2007,6(12):1938-1943.

[4]张燕明,徐力,陈信义.茶多酚抗移植性乳腺癌作用的研究[J].国际中医中药杂志,2006,28(6):354-356.

[5]魏芳,刘浩,张配等.EGCG对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制作用及机制[J].中国药理学通报,2013,29(5):680-684.

[6]温旭烨.茶叶提取物及纳米EGCG对人乳腺癌MCF-7细胞生长增殖的影响[D].西南大学,2014.

[7]吴菲,田绘绘,季德鑫等.茶氨酸和其衍生物茶氨酸氯香酰胺对高转移的人乳腺癌细胞生长的抑制作用[J].安徽农业大学学报,2014,41(6):911-916.

[8]金永淑,郑金贵,杨江帆等.不同产地铁观音生化品质的差异分析[J].江苏农业科学,2013,41(12):325-327.

[9]林金科,陈钦宾,王晓霞等.增湿晒青对清香型夏暑乌龙茶品质的影响[J].中国农学通报,2011,27(7):409-413.

[10]黄东方.不同品质风格安溪铁观音采制技术 [J].中国茶叶,2008(7): 20-21.

[11]苏鹏鸣.安溪铁观音不同地域茶叶品质特征分析[J].福建茶叶,2011, 33(6):42-44.

[12]叶媚娜,陈红风.黄芪注射液对basal-like型乳腺癌细胞MDA-MB-468培殖的影响[J].2008.

[13]丁菲菲,张晓静,邓雁如.杠柳毒苷体外抑制肝癌细胞和乳腺癌细胞增殖的实验研究[J].药物评价研究,2014(1):30-33.

[14]戎煜,梁福佑.去甲斑蝥素对人乳腺癌细胞系的凋亡诱导作用及bcl—2基因的表达[J].癌症:英文版,2000,19(12):1077-1081.

[15]张虹.S-烯丙基巯基半胱氨酸初步药学评价及抗乳腺癌机制研究[D].山东大学,2014.

[16]燕慧,王捷,杨自飞等.BSP基因RNA干扰对乳腺癌MDA-MB-231BO细胞生物学特性的影响[J].生物技术通报,2010,6(27):142-145.

[17]钟警,陈亚军,汤帅等.蛋白质精氨酸甲基转移酶2在乳腺癌细胞中的表达及其对SKBR-3细胞生长特性的影响[J].肿瘤,2010,30(12):991-997.

[18]尚泽森,马丽清.表没食子儿茶素没食子酸酯抑制乳腺癌细胞增殖和迁移[J].中国生物化学与分子生物学报,2015,31(2):207-212.

[19]易香华.普洱茶抑制乳腺癌SHZ-88细胞及保护亚基肌诱导的胃癌前病变和放疗损伤的作用[D].广州:广州中医药大学,2010.

[20]Pirnia F,Schneider E,Betticher D C,et al.Mitomycin C induces apoptosis and caspase-8 and-9 processing through a caspase-3 and Fas-independent pathway[J].Cell death and differentiation,2002,9(9):905.

[21]Pozo‐Guisado E,Merino J M,Mulero‐Navarro S,et al.Resveratrol‐induced apoptosis in MCF‐7 human breast cancer cells involves a caspase‐independent mechanism with downregulation of Bcl‐2 and NF‐κB[J].International journal of cancer,2005,115(1):74-84.

[22]Fu Y G,Qu Y J,Wu K C,et al.Apoptosis-inducing effect of recombinant Caspase-3 expressed by constructed eukaryotic vector on gastric cancer cell line SGC7901[J].World journal of gastroenterology,2003,9(9):1935-1939.

[23]王旭,强兆艳,王翔等.塞来昔布与茶多酚合用对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响[J].天津医科大学学报,2014,20(1):14-17.

[24]徐泽平.茶多酚诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡及机理研究 [D].华南理工大学,2011.

安溪县人民政府科技资助项目（KH1500790，K1515059A）；福建农林大学科技发展资金（KF2015122）。

林 玲（1990-），女，硕士研究生，主要从事茶叶保健功能研究。

*通讯作者：林金科（1967-），男，教授，主要从事茶深加工与保健、茶资源育种与生物技术方面研究。E-mail：ljk213@163.com。