三倍体无籽西瓜子叶节再生体系建立与嫁接育苗技术探究

闵子扬，阮万辉，张屹，朱菲莹，肖姬玲，李基光，刘建雄，梁志怀

（湖南省西瓜甜瓜研究所长沙410125）

三倍体无籽西瓜子叶节再生体系建立与嫁接育苗技术探究

闵子扬，阮万辉，张屹，朱菲莹，肖姬玲，李基光，刘建雄，梁志怀

（湖南省西瓜甜瓜研究所长沙410125）

以三倍体无籽西瓜品种‘超庭三号’子叶节为外植体，对影响子叶节离体再生及嫁接育苗技术的关键因子进行了研究。结果表明，3%的次氯酸钠溶液消毒18 min是三倍体无籽西瓜种胚消毒的最佳方式；2.5 mg·L-16-BA+ 0.1 mg·L-1NAA是诱导三倍体无籽西瓜子叶节产生不定芽的最佳激素组合，不定芽分化系数最高达6.11；0.2 mg·L-1KT能有效诱导不定芽伸长；将长度为2.5 cm的接穗嫁接到子叶刚展平的南瓜砧木上，成活率高达84.40%。试验成功建立了三倍体无籽西瓜子叶节再生及嫁接育苗技术体系。

无籽西瓜；三倍体；子叶节；再生体系；嫁接

中国是世界上西瓜（Citrullus lanatus）生产与消费第一大国[1]，市场潜力巨大，其中三倍体无籽西瓜具有比普通二倍体西瓜糖度更高、食用更加方便、宜于机械化采收、区域流动性强等优点[2]，更加契合我国西瓜产业发展的需求，因此逐年受到人们的重视。但是，三倍体无籽西瓜生产中存在采种量低、发芽率低、成苗率低的“三低”问题，导致三倍体无籽西瓜种子价格昂贵、育苗技术性强，严重制约我国无籽西瓜产业的发展。组织培养技术的快速发展为打破三倍体无籽西瓜“三低”问题带来了曙光，利用该技术可在短时间内获得大量优质无籽西瓜试管苗，大大简化三倍体无籽西瓜繁琐的育苗程序，降低生产成本，带来显著的社会效益和经济效益。

前人关于三倍体无籽西瓜子叶节再生及嫁接育苗的研究已有报道，研究内容主要集中在外植体的选择、诱导培养基的筛选等方面，但建立的再生体系并不完善，存在诱导出芽率低、受外植体基因型影响大、再生植株移栽成活困难等问题[3-5]。笔者在建立高效不定芽诱导体系的基础上，对所得不定芽不进行生根诱导而是直接进行嫁接，目的是建立一套稳定、高效的三倍体无籽西瓜子叶节再生及嫁接育苗技术体系，以期在降低三倍体无籽西瓜生产用种量、简化育苗程序、工厂化生产嫁接苗、提高品种纯度等方面奠定基础，同时也为西瓜基因工程相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试三倍体无籽西瓜品种为‘超庭三号’，购于新疆科世达种业有限公司，该品种生长势强健，瓤黄色，品质优良，单瓜质量7～11 kg；砧木为西瓜嫁接专用品种‘白籽南瓜’。试验于2015年9月在湖南省西瓜甜瓜研究所组织培养实验室进行，嫁接后植株置于嫁接愈合室直至植株成活。

1.2 方法

1.2.1 消毒时间对种胚污染率和发芽率的影响选取质量较好的‘超庭三号’无籽西瓜种子，小心剥去种壳并尽量不伤及种胚，首先在25℃的恒温水中浸种4～6 h，然后将其在超净工作台上用75%的酒精表面消毒30 s、无菌水冲洗3次，再置于3%的次氯酸钠溶液中分别消毒12、15、18、21 min，以观察不同消毒时间对种胚污染率和发芽率的影响。消毒期间不断搅拌以加强消毒效果，无菌水冲洗5～6次后用无菌滤纸吸干种胚表面水分，接种到不添加任何激素的MS培养基上进行暗培养4 d，待种胚发芽后转入光下培养，光周期为16 h光照/8 h黑暗，光强2 500 lx，整个培养期间一直处于（25±1）℃的温度条件下。以上各项每处理均接种30粒种胚，3次重复。

1.2.2 不同激素组合对三倍体无籽西瓜不定芽诱导及伸长的影响以光培养2 d的三倍体无籽西瓜种胚为材料，整体切取其子叶节部分为外植体[6]，将其接种于不同质量浓度6-BA（2.00、2.50、3.00 mg·L-1）和NAA（0.05、0.10、0.15 mg·L-1）组成的诱导培养基中，探究诱导不定芽增殖的最佳激素组合；将诱导出的不定芽切割成单芽，接种于含不同质量浓度的NAA（0.10、0.20、0.30 mg·L-1）或KT（0.10、0.20、0.30 mg·L-1）的培养基中，探究适宜于不定芽伸长的最佳培养基。不定芽诱导及伸长过程中，均以MS培养基为基本培养基，pH值5.8，添加30 g·L-1的蔗糖、7 g·L-1的琼脂粉，整个培养期间均置于光照16 h·d-1，光强2 500 lx，温度（25±1）℃的环境中进行培养。培养30 d后统计不定芽诱导率，不定芽转接14 d后记录不定芽伸长效果。以上各项每处理均接种20个外植体，3次重复。

1.2.3 影响嫁接成活因素的探究采用顶插接的方法，将经过适应性锻炼后、长度不同（2.0、2.5、3.0 cm）的单个不定芽嫁接到子叶刚展平的南瓜砧木上，以探究试管苗大小对嫁接成活率的影响。将嫁接苗置于嫁接愈合室中，前3 d严格盖膜以保持湿度100%，白天温度（27±1）℃，夜间温度（25±1）℃，5～6 d后逐渐通风降温，其他同嫁接苗常规管理，长出新叶后视为嫁接成活。以上各项每处理取嫁接苗30株，3次重复，14 d后统计不同处理间嫁接成活率。

1.2.4 数据统计及分析以上试验取得的试验数据按下列公式计算污染率等指标。

污染率/%=（污染外植体数/接种外植体总数）× 100；

不定芽诱导率/%=（出芽外植体数/接种外植体总数）×100；

不定芽分化系数/%=（形成不定芽总个数/出芽外植体总数）×100；

建设智慧校园旨在推动下一代数字技术在智慧校园建设中的创新应用，改造和优化现行校园网络环境，构建高速泛在、智能灵活、开放共享、安全可靠的校园信息环境。2015年以来，学校启动了智慧校园建设，并将智慧校园建设列入学校“十三五”规划重点项目，设立智慧校园建设专职系统集成、软件研发和推广团队，保障智慧校园试点项目顺利实施。

嫁接成活率/%=（嫁接成活植株数/总嫁接植株数）×100；

采用SPSS 17.0软件对以上各数据进行方差分析和Duncan’s多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对三倍体无籽西瓜种胚污染率及发芽率的影响

外植体用75%的酒精消毒30 s后，再用不同时间的3%次氯酸钠溶液消毒，以探究最佳消毒方式。从表1中可以看出，当消毒时间为12 min时，污染率高达63.33%，与其他处理之间存在显著差异；虽然剩余未污染外植体萌芽率较高，但由于大部分外植体已经污染，其总体萌芽率处于所有处理的最低值，为31.13%，显著低于其他处理。随着消毒时间延长，外植体的污染率逐渐降低，当消毒时间达到21 min时，污染率降为0，但是此时次氯酸钠溶液对种胚的毒害作用同样加强，导致种胚的萌芽率只有64.40%，显著低于消毒18 min时。消毒时间为18 min时，外植体污染率仅为2.22%，与消毒21 min时差异不显著，消毒效果较好，并且此时种胚萌芽率在所有处理中达到最高值，为82.21%，显著高于其他处理。综上分析认为，在3%的次氯酸钠溶液中消毒18 min，是三倍体无籽西瓜种胚消毒的最佳方式。

表1 不同消毒时间对三倍体无籽西瓜种胚污染率及发芽率的影响

2.2 不同激素组合对不定芽增殖的影响

外源激素是诱导西瓜子叶节产生不定芽的必要物质，其种类及配比对不定芽诱导率和分化系数起决定性作用。

由表2可知，NAA质量浓度一定时，随着6-BA质量浓度的增加，不定芽诱导率和分化系数均逐渐升高，当6-BA质量浓度为3.0 mg·L-1时，不定芽诱导率最高，达85.02%，分化系数6.03，但其与6-BA质量浓度为2.5 mg·L-1时的不定芽诱导率和分化系数之间差异不显著，均处于较高水平，但6-BA质量浓度3.0 mg·L-1时诱导出的芽大部分为叶丛芽，没有茎的产生，不利于后期单芽的伸长及嫁接，故6-BA质量浓度为2.5 mg·L-1时较适宜不定芽的诱导。当6-BA质量浓度一定时，随着NAA质量浓度的增加，不定芽诱导率呈先增后降的趋势，说明低质量浓度的NAA有利于不定芽的生长，但质量浓度过高时则抑制其生长。在与6-BA组合使用过程中发现，NAA质量浓度为0.1 mg·L-1时不定芽诱导率均呈现出明显优势，因此NAA质量浓度0.1 mg·L-1较适宜西瓜不定芽的诱导。综上分析，2.5 mg·L-16-BA+ 0.1 mg·L-1NAA是诱导三倍体无籽西瓜子叶节产生不定芽的最佳激素组合（图1-A）。

表2 不同激素组合对诱导分化不定芽的影响

2.3 不同激素对不定芽伸长的影响

分别使用3种不同质量浓度的NAA或KT进行不定芽伸长诱导试验，结果表明，不同质量浓度的NAA或KT均能诱导不定芽的伸长，但是以NAA进行诱导时不定芽生长速度缓慢，基部出现愈伤化不定根并随着NAA质量浓度的增加愈伤化程度逐渐加重（图1-B），不利于后期嫁接；以KT进行诱导时，不定芽生长迅速、茎秆健壮且基部无愈伤组织形成（图1-C），后期嫁接成活率高，其质量浓度以0.2 mg·L-1较为适宜，过高时不定芽生长瘦弱，不利于成活。

2.4 接穗长度对嫁接成活率的影响

由表3可知，接穗长度为2.5 cm时，嫁接成活率最高，达84.40%，与其他2种接穗长度之间存在显著差异。接穗长度为2.0 cm左右时生长势较弱，木质化程度低，维管束发育不完全，不能很好的跟砧木贴合，导致嫁接成活率较低。接穗长度为3.0 cm左右时，不定芽生长时间较长且茎秆较粗，不易插入砧木，同样影响成活率。本试验没有进行砧木大小对嫁接成活率影响的研究，主要因为南瓜砧木的下胚轴很容易出现中空现象，砧木苗龄过大时嫁接成活率急剧降低。综上认为，接穗长度为2.5 cm时嫁接到子叶刚展平的南瓜砧木上是三倍体无籽西瓜组培苗适宜的嫁接条件（图1-D）。

图1 子叶节诱导出芽及嫁接成活过程

表3 不同接穗长度对嫁接成活率的影响

3 讨论与结论

在三倍体无籽西瓜再生体系建立的过程中，可使用的外植体种类很多，目前已报道的有茎尖、芽、下胚轴、子叶等，但是普遍存在诱导率较低的问题。笔者以三倍体无籽西瓜的子叶节为外植体，不定芽诱导率高达83.32%、分化系数达6.11，说明子叶节是适宜建立三倍体无籽西瓜再生体系的外植体类型，这与张慧君等[7]在甜瓜上的研究结论是一致的。

6-BA是三倍体无籽西瓜再生体系建立过程中必不可少的激素，其浓度对诱导率的高低及芽的质量起决定性作用，浓度较低时不定芽诱导率低，过高时则容易形成叶丛芽，不利于后期成苗。适宜质量浓度的NAA或KT均能诱导不定芽的伸长，但以0.2 mg·L-1的KT进行诱导时，不定芽生长健壮、基部无愈伤组织形成，有利于后期嫁接成活，这与肖守华等[8]的结论一致。

接穗长度是影响嫁接苗成活率的关键因子[9]，笔者将经过适应性锻炼后、长度2.5 cm左右的不定芽嫁接到子叶刚展平的南瓜砧木上，嫁接成活率高达84.4%，并且此方法省去了试管苗诱导生根、炼苗移栽、驯化成活等步骤，提高了生产效率，能有效应用于生产实践。试验过程中也发现一些问题，如部分试管苗茎秆较实生苗粗壮，作为接穗时不能紧密的插入砧木，造成试管苗嫁接利用率低；试管苗生产周期长、嫁接后缓苗时间长等问题有时会导致生产出的嫁接苗赶不上农时，制约了该项技术的应用。提高接穗可利用率、简化嫁接程序及加强嫁接后管理需进一步深入探究。

本研究结果表明，以三倍体无籽西瓜子叶节为外植体可建立高效的再生体系，其最佳诱导培养基为2.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，不定芽分化系数最高可达6.11。诱导获得的不定芽在MS+ 0.2 mg·L-1KT的培养基中生长迅速且状态好，有利于后期的嫁接。将长度为2.5 cm的接穗嫁接到子叶刚展平的南瓜砧木上，成活率高达84.40%。本试验成功建立了三倍体无籽西瓜子叶节再生及嫁接育苗技术体系，在降低三倍体无籽西瓜生产用种量、简化育苗程序、工厂化生产嫁接苗、提高品种纯度等方面奠定了基础，同时也可为西瓜基因工程相关研究提供参考。

[1] 刘文革，何楠，赵胜杰，等．我国三倍体无籽西瓜的周年生产与栽培[J]．长江蔬菜，2014（14）：1-6．

[2] 赵姜．中国西瓜产业发展的经济学分析[D]．北京：中国农业科学院，2013．

[3] 王闯，李中勇，刘敏，等．无籽西瓜茎段组织培养与嫁接育苗技术研究[J]．中国农学通报，2010，26（5）：189-192．

[4] 汤月丰，周泉，马陆平．无籽西瓜组织培养与嫁接育苗技术研究[J]．湖南农业科学，2006（5）：43-44．

[5] 许念芳，刘少军，藏传江，等．无籽西瓜的组培快繁技术研究[J].山东农业科学，2013，45（7）：12-14．

[6] 阎志红，刘文革，赵胜杰，等．四倍体西瓜子叶植株再生试验[J].中国果树，2007（6）：28-31．

[7] 张慧君，高鹏，栾非时．甜瓜自交系离体子叶节再生体系的建立[J]．江苏农业科学，2012，40（3）：50-52．

[8] 肖守华，李国生，焦自高，等．西瓜高效再生体系的建立[J]．中国瓜菜，2010，23（3）：11-14．

[9] 李建欣，庞淑敏，李建吾，等．黄瓜组织培养与组培苗嫁接研究[J]．农业科技通讯，2012（2）：60-63．

·书讯·

《甜瓜种质资源描述规范和数据标准》由中国农业科学院郑州果树研究所主持编写，并得到了全国甜瓜科研、教学和生产单位的大力支持。甜瓜种质资源描述规范和数据标准的制定是国家农作物种质资源平台建设的重要内容，共分三大部分，其中甜瓜种质资源描述规范规定了甜瓜种质资源的描述符及其分级标准，以便对甜瓜种质资源进行标准化整理和数字化表达。甜瓜种质资源数据标准规定了甜瓜种质资源各描述符的字段名称、类型、长度、小数位、代码等，以便建立统一的、规范的甜瓜种质资源数据库。甜瓜种质资源数据质量控制规范规定了甜瓜种质资源数据采集全过程中的质量控制内容和质量控制方法，以保证数据的系统性、可比性和可靠性。

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Establishment of the cotyledon node regeneration system and vitrografting technology in triploid seedless watermelon

MIN Ziyang，RUAN Wanhui，ZHANG Yi，ZHU Feiying，XIAO Jiling，LI Jiguang，LIU Jianxiong，LIANG Zhihuai
（Hunan Watermelon and Muskmelon Institute，Changsha 410125，Hunan，China）

In this paper，we used seedless watermelon‘Chaoting No.3’cotyledonary node as explants for the establish⁃ment of seedless watermelon cotyledon node regeneration and grafting breeding technology system to investigate the key fac⁃tors affecting cotyledon node regeneration in vitro and the grafting seedling techniques.The result showed that 3%of sodium hypochlorite solution of 18 min was the best disinfection technique to seedless embryo.2.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA had the best adventitious bud induction in seedless watermelon，the differentiation coefficient of adventitious bud was as high as 6.11.0.2 mg·L-1KT could effectively induce adventitious bud to elongate.Scions with 2.5 cm in length which were grated to pumpkin root stocks with flatted cotyledon had the the highest survival rate(84.4%).In the experiment，we suc⁃cessfully established the system of cotyledon node regeneration and vitro-grafting technology in triploid seedless watermelon.

Seedless watermelon；Triploid；Cotyledon node；Regeneration system；Grafting

2016-05-21；

2016-10-17

湖南省科技厅重点研发项目（2015NK3047）;湖南省科技厅重点研发项目（2016NK2193）;国家公益性行业（农业）科研专项（201503110-03）

闵子扬，男，研究实习员。主要从事葫芦科蔬菜倍性育种相关研究。E-mail：minziyang1220@163.com

梁志怀，男，研究员。主要从事植物病理学相关研究。E-mail：1178640839@qq.com