胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中的作用研究

胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中的作用研究

宋海涛 盛玉龙 刘国香 孙广宁 张秀荣 尹凤玲 路中

目的探讨胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中的作用。方法体外培养胃癌干细胞CSC-G和普通胃癌细胞SGC7901采用Western blot法检测两种胃癌细胞中干细胞标志物的表达情况，对比两种胃癌细胞的侵袭性检测结果和球形克隆形成情况。结果胃癌干细胞CSC-G的干细胞标志物SOX2、OCT4的表达水平高于胃癌细胞SGC7901（P＜0．05）。球形克隆检测结果显示，胃癌干细胞CSC-G的瘤球数量为（65．49±10．22）个，多于胃癌细胞SGC7901的（7．36±1．14）个（P＜0．05）。侵袭能力检测结果显示，胃癌干细胞CSC-G穿过基底膜的数量为（168．71±32．50）个，多于胃癌细胞SGC7901的（92．44±13．06）个（P＜0．05）。结论胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移过程中发挥着促进作用。

胃癌干细胞；CSC-G；胃癌侵袭；胃癌转移

胃癌患者预后较差，现阶段我国临床迫切需要能够用于评估胃癌患者疾病侵袭和转移情况的指标，旨在能够尽早发现患者疾病复发征兆，及时采取治疗措施，预防疾病的复发[1]。胃癌干细胞是一类具有自我更新、自我分化潜能的癌细胞，难以被化疗、放疗杀死，目前被认为是引起胃癌患者疾病复发的主要原因[2]。本研究对胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中的作用进行深入探讨，现将研究内容进行以下报导。

1 材料与方法

1.1 一般材料

使用材料：胃癌干细胞CSC-G、普通胃癌细胞SGC7901，两者均由中国科学院上海细胞库提供。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 将胃癌细胞SGC7901冻存管取出置入水浴中融化，转移至培养皿中，在培养皿中加培养液培养，第2天更换培养液，在光学显微镜下观察细胞产生长情况。待培养皿中的细胞数量超过85%时进行细胞传代培养，将营养液吸出，使用磷酸缓冲盐溶液洗涤，经胰蛋白酶消化，加含有血清的培养液终止消化，制成细胞混悬液分装至不同的培养瓶中加培养液继续培养。选择各培养品中生长良好的细胞，再次使用磷酸缓冲盐溶液洗涤，经胰蛋白酶消化，将细胞转移至离心试管中进行离心，弃上清液，冻存在-80℃的冰箱中，次日转移至液氮罐中。最终将胃癌细胞SGC7901接种至PRMI培养基中培养，每间隔2日更换1次培养液，当细胞融合比例高于90%时进行胰蛋白酶消化和传代培养。将胃癌干细胞CSC-G接种至无血清的DMEM/F12培养基中进行培养，每日均添加一次营养液，10 d后进行传代培养。

1.2.2 球形克隆试验 两种细胞传代培养10 d后进行球形克隆试验，评价两种细胞在胃癌转移中的作用。将两种细胞分别接种至6孔板中进行培养，均加入无血清培养基进行培养，每日在光学显微镜下观察两种细胞的瘤球形成情况，连续培养3周，取两种细胞随机3个显微镜视野统计瘤球个数，取三个视野的平均值。

1.2.3 干细胞标志物检测 采用Western blot法检测两种胃癌细胞中干细胞标志物的表达情况，传代培养10 d后取生长良好的细胞，磷酸缓冲盐溶液洗涤后，消化离心，经RIPA裂解液裂解，经超声粉碎后再次离心，获得细胞总蛋白，采用BCA法检测相关蛋白表达水平。

1.2.4 侵袭性检测 取生长良好的传代培养10 d后的细胞，使用无血清培养基稀释ECW基质胶培养，然后加入到Transwell小室中悬浮，并在小室中加入含胎牛血清的培养基继续培养，最后将Transwell小室取出，风干，染色，磷酸缓冲盐溶液洗涤，在显微镜下进行拍照计数。

1.3 观察指标

对比胃癌干细胞CSC-G、普通胃癌细胞SGC7901的干细胞标志物的表达水平以及两种细胞的侵袭能力、转移能力。

1.4 数据分析处理

基于SPSS 21.0版本统计学软件建立数据分析模型，计量资料均以（均数±标准差）的形式描述，指标差异采用独立样本t检验，P＜0.05表示两者比较差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种细胞的干细胞标志物表达水平比较

检测结果显示胃癌干细胞CSC-G的干细胞标志物SOX2、OCT4的表达水平高于胃癌细胞SGC7901（P＜0.05），β-actin的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），详见图1所示。

2.2 两种细胞的球形克隆试验结果比较

球形克隆检测结果显示，胃癌干细胞CSC-G的瘤球数量多于胃癌细胞SGC7901，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05），详见表2所示。

2.3 两种细胞的侵袭能力比较

侵袭能力检测结果显示，胃癌干细胞CSC-G穿过基底膜的数量多于胃癌细胞SGC7901，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05），详见表2所示。

表2 两种细胞的球形克隆试验结果、侵袭能力比较

3 讨论

胃癌是我国临床最为常见的一种消化系统恶性肿瘤疾病，好发于50岁以上的人群，男性发病率高于女性，具有复发率高、预后不佳的临床特点[3-4]。据不完全数据统计结果显示，我国每年约有68万例胃癌新发病例，占全球胃癌病例的50%左右，其中大部分患者在诊断时已为进展期胃癌，治疗难度大，术后复发率高。利用胃癌干细胞治疗胃癌是现阶段我国医疗领域的研究热点[5]。胃癌干细胞是患者肿瘤组织中具有自我更新能力和多向分化能力的肿瘤细胞，该类肿瘤细胞的杀死难度较普通胃癌细胞大，因此患者肿瘤组织中胃癌干细胞数量越多，预后越差[6-7]。

图1 两种细胞的干细胞标志物β-actin、SOX2、OCT4的表达情况

长期临床研究发现，胃癌干细胞具有特异性，并不是所有胃癌干细胞均具有侵袭和转移的能力。目前，我国临床尚未完全明确胃癌的发病机制，近年来不断有研究学者通过对胃癌干细胞的作用机制进行分析，探讨胃癌患者疾病复发的原因，寻找制定胃癌治疗方案的新思路和新方向[8]。本研究对胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中的作用进行探讨，研究结果显示胃癌干细胞CSC-G的干细胞标志物SOX2、OCT4的表达水平高于胃癌细胞SGC7901，球形克隆瘤球数量和穿过基底膜数量均多于胃癌细胞SGC7901。李向辉[9]等的临床研究也对胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中的作用进行探讨，结果显示胃癌干细胞CSC-G克隆瘤球数量和穿过基底膜的数量均明显升高，认为胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中发挥着重要作用。本次研究结果与李向辉等的研究结果一致。

对上述研究结果进行深入分析认为胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中发挥的作用明显强于普通胃癌细胞SGC7901，与患者疾病复发存在密切关系，可通过监测胃癌干细胞对患者疾病复发及预后进行评估。

[1] 乐雄，杨德同，张洪海，等． 胃癌干细胞对氟尿嘧啶敏感性及化疗药物耐受细胞的生物学机制[J]． 中国组织工程研究，2015，19（19）：3022-3026．

[2] 黄辉，潘志坚． 胃癌干细胞在胃癌侵袭、转移中及血管形成中的作用和机制[J]． 中国组织工程研究，2016，20（14）：2021-2026．

[3] Liu G，Neumeister M，Reichensperger J，et al． Therapeutic potential of human adipose stem cells in a cancer stem cell-like gastric cancer cell model[J]． International journal of oncology，2013，43（4）：1301-1309．

[4] 文利红，胡文杰，叶恒曦，等． 胃癌干细胞抗原负载树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞[J]． 中国组织工程研究，2016，20（36）：5345-5350．

[5] 唐家平，李晋，李锦毅． 胃癌干细胞抗原负载的DC-CIK对胃癌细胞的杀伤活性[J]． 肿瘤防治研究，2013，40（10）：917-920．

[6] 金健，窦金霞，刘子艳，等． 靶向胃癌干细胞树突状细胞共培养细胞因子诱导的杀伤细胞治疗晚期胃癌患者的疗效观察[J]． 中国慢性病预防与控制，2015，23（12）：938-939．

[7] Yu L，Yang L，An W，et al． Anticancer bioactive peptide-3 inhibits human gastric cancer growth by suppressing gastric cancer stem cells[J]． Journal of Cellular Biochemistry，2014，115（4）：697-711．

[8] 吴炜，姜相君． PSCA rs2294008基因多态性与胃癌癌前病变的相关性研究[J]． 胃肠病学，2016，21（12）：733-736．

[9] 李向辉，王贵吉． 胃癌干细胞CSC-G在胃癌侵袭和转移中的作用[J]． 中国组织工程研究，2016，20（11）：1597-1602．

Study on the Role of CSC-G in Gastric Cancer Stem Cells in Invasion and Metastasis of Gastric Cancer

SONG Haitao SHENG Yulong LIU Guoxiang SUN Guangning ZHANG Xiurong YIN Fengling LU Zhong Department of Oncology, Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang Shandong 261031, China

ObjectiveTo investigate the role of CSC-G in gastric cancer stem cell invasion and metastasis.MethodsThe expression of stem cell markers in gastric cancer stem cells (CSC-G) and SGC7901 cells weredetected by Western blot. The invasive test results and the formation of spherical clones were compared between the two gastric cancer cells.ResultsThe expression levels of SOX2 and OCT4 in gastric cancer stem cells were signif i cantly higher than those in gastric cancer cells SGC7901 (P＜ 0.05). The number of tumor cells in gastric cancer stem cells was (65.49±10.22), which was more than that of gastric cancer cells SGC7901 (7.36±1.14) (P＜ 0.05). The number of CSC-G through gastric basement cells was (168.71±32.50), which was higher than that of gastric cancer cell SGC7901 (92.44±13.06) (P＜ 0.05).ConclusionCSC-G plays an important role in the invasion and metastasis of gastric cancer.

gastric cancer stem cells; CSC-G; gastric cancer invasion; gastric cancer metastasis

R735．2

A

1674-9316（2017）11-0136-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．11．082

山东省医药卫生科技发展计划项目（2013WS0293）

山东省潍坊医学院附属医院肿瘤内科，山东 潍坊 261031

路中