一例猪传染性胃肠炎的RT-PCR诊断

方振华 沈振国 孙 倩

(海南职业技术学院热带农业技术学院,海南海口 570216)

一例猪传染性胃肠炎的RT-PCR诊断

方振华 沈振国 孙 倩

(海南职业技术学院热带农业技术学院,海南海口 570216)

2016年11月，海南省某猪场发生一起疑似猪传染性胃肠炎病。根据猪传染性胃肠炎病毒N基因序列设计、合成1对引物，应用RT-PCR技术对病死猪的肠道内容物等组织进行RT-PCR扩增，扩增出预期目的基因。结合临床症状和病理剖检变化初步诊断为猪传染性胃肠炎病毒。

猪 猪传染性胃肠炎 RT-PCR诊断

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种急性、高度接触性的肠道传染病。各年龄段的猪均能发病，以1周龄以下的仔猪死亡率最高，随着年龄的增加死亡率会降低，但同时饲料报酬也会降低，严重影响猪的料肉比。该病在养猪中常有发生，给养猪业的发展造成了巨大的经济损失，极大地制约了畜牧业的健康发展。2016年11月底，海南省海口市某猪场发生一起以猪呕吐、水样腹泻为主要症状的疾病，经RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒阳性，结合临床症状、病理剖检变化初步诊断为猪传染性胃肠炎。

1 发病情况

2016年11月下旬，海南省某猪场仔猪突然发病，仔猪出现呕吐，呕吐物中有未消化的乳块，接着发生淡黄色水样腹泻，很快波及全舍。成年猪食欲不振，出现腹泻，粪便呈灰褐色，腥臭。发病猪精神沉郁，口渴明显，脱水症状严重，个别仔猪发病3d后死亡。根据其临床表现，初步怀疑为猪传染性胃肠炎。

2 剖检变化

对病死的仔猪进行剖检，可见尸体明显消瘦、脱水，胃内充满未消化的白色凝乳块，胃壁黏膜充血；小肠壁变薄，呈半透明状；肠道内充满气体，肠壁树枝状充血，肠腔内有呈灰色的泡沫状液体和未彻底消化的凝乳块，空肠黏膜剥落；肠系膜充血，淋巴结肿胀。

3 实验室检查

采集病猪的肠道内容物，采用RT-PCR方法检测。

3.1 引物的设计与合成

试验所用引物位于N基因内，预期扩增片段为386 bp，上游引物：5’-AGAGGCAGGCAACAATCCAA-3’，下游引物：5’-GTGACTTCTATCTGGTCGCCAT-3’。

3.2 检测样品的制备

采集肠道内容物研磨，用生理盐水2倍稀释，反复冻融3次，4℃ 5000 r/min 离心10 min，收集上清液体，加入双抗备用。

3.3 病毒基因组总RNA 提取

按照总RNA 提取试剂盒（北京索莱宝）的说明步骤进行。

3.4 猪传染性胃肠炎病毒N基因的RT-PCR扩增

cDNA合成：以提取的总RNA 为模板，以Oligo（d T）18为引物进行 RT 反应。反应体系为：总RNA 2 μl，Oligo（d T）18（0.5 μg/μl）1 μl，2×TS Reaction Mix 10 μl，Trans Script RT/ RI Enzyme Mix 1 μl，RNase-free Water 5 μL。反应条件为：42 ℃孵育 30 min，85 ℃ 5 min。

反转录产物存于-20℃，保存备用。

PCR反应体系：模板cDNA 2 μL，Premix Taq 12.5 μl，上下游引物（20 μmol/L）各1 μl，用灭菌的ddH2O补至25 μl。反应程序：94℃预变性5 min；94 ℃变性30s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34个循环，循环结束后72 ℃延伸10 min。反应完毕，取PCR产物6 μl，加入上样缓冲液，在有goldviewII的1.0%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察。可扩增得到1条386 bp 的特异性条带（图1），表明待测样品为阳性，同时结合临床症状和病理变化，诊断该猪场病猪为猪传染性胃肠炎病毒感染。

图1 猪传染性胃肠炎病毒N基因的PCR 产物电泳结果

4 讨论

近年来，猪传染性胃肠炎发病率持续上升，其流行情况日趋严重，临床很难确诊[4]。猪是唯一易感宿主，传染源为病猪和带毒猪，病猪的呕吐物和排泄物中都可能传播该病毒。并且极易造成其他肠道疾病的混合或继发感染，使疫情变得更加复杂，提高病死率，对养殖业造成严重的经济损失。由于猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻和猪轮状病毒感染的症状极为相似，给临床诊断和防治带来了重重困难。而常规的病毒分离鉴定、免疫荧光等检测手段费时费力，而且敏感性不强，无法满足需要。RT-PCR反应以其特异性强、灵敏度高和操作方便等优点，成为猪传染性胃肠炎诊断的主要方法[5]，为猪传染性胃肠炎的早期诊断和流行病学调查奠定了理论基础。N基因是猪传染性胃肠炎病毒基因片段中相对保守的一个基因[6]，其结构的高度保守性，在病毒的诊断方面具有很重要的意义。

[1] 樊长林，穆晓旭，刘泽.猪传染性胃肠炎及其防控措施[J].中国畜牧兽医文摘，2016，32（4）：124.

[2] 白云云，葛旭影，高睿泽，等.猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其S 基因分子生物学特征的分析[J].中国兽医科学，2016，46（3）：296-302.

[3] 张慧玲.猪传染性胃肠炎预防和治疗的研究进展[J].中国畜牧兽医文摘，2012，28（8）：108.

[4] 王文娟.猪传染性胃肠炎的诊断[J].甘肃畜牧兽医，2015，45（5）：70-71.

[5] 兰喜.猪传染性胃肠炎病毒的分子诊断与免疫研究[D].中国农业科学院，2006.

海南省自然科学基金项目（20153086）.

方振华（1980-），男，硕士，讲师，研究方向：动物营养与动物疾病。