水产品中隐性孔雀石绿的测定

蒙君丽 宋荪阳 董晓杰

(1.唐山市畜牧水产品质量监测中心,河北唐山 063000; 2.唐山市船检处,河北唐山 063000)

水产品中隐性孔雀石绿的测定

蒙君丽1宋荪阳1董晓杰2

(1.唐山市畜牧水产品质量监测中心,河北唐山 063000; 2.唐山市船检处,河北唐山 063000)

运用酶联免疫法（ELISA）对水产品中隐性孔雀石绿测定的方法进行研究。结果表明，向样品中分别添加0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/kg 6个不同质量浓度的隐性孔雀石绿时，平均回收率为78.2%～110%，检出限0.5 μg/kg，定量限1.5 μg/ kg。同时采用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）验证，结果与ELISA结果一致。该方法准确度较好，适合水产品中隐性孔雀石绿的快速检测。

酶联免疫吸附法 液相色谱串联质谱法 水产品 隐性孔雀石绿 快速检测

孔雀石绿（malachite Green，MG）是一种合成的三苯基甲烷类染料，进入机体后，通过生物转化，还原成脂溶性隐性孔雀石绿（leucomalachite green，LMG），在组织中残留时间较长[1]，具有潜在的致癌性[2-3]，所以实验室常用隐性孔雀石绿作为标记检测物。鉴于隐性孔雀石绿的危害性，目前许多国家都将其列为水产养殖禁用药物。加拿大于1992年就禁止将其作为渔场杀菌剂。1993年美国FDA已经将隐性孔雀石绿列为优先研究的致癌性化学物质，并规定在食用水产品中禁止检出孔雀石绿和隐性孔雀石绿[4]。欧盟于2002年6月颁布法令禁止在渔场中使用孔雀石绿[5]。中国于2002年将孔雀石绿列入《食品动物禁用的渔药及其化合物清单》中，禁止用于所有食用动物的养殖中。本实验仅对隐性孔雀石绿作为对象进行研究。

目前隐性孔雀石绿的主要检验方法有分光光度法、酶联免疫吸附法（ELISA）[6-9]、高效液相色谱法（LC）[10-12]和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）[13-16]等。酶联免疫吸附法是一种半定量的方法，其检测结果不能作为最终的确证，因此该方法还具有一定的局限性，需要采用液相色谱和液相色谱串联质谱方法进行确证。液相色谱串联质谱法灵敏度高，定量准确，但由于其成本高，检测耗时长，对操作仪器设备人员要求较高，因此并不适用所有实验室检测。采用ELISA快速筛选与液相色谱串联质谱的确证方法相结合，既节约了成本，缩短了检测时间，又提高了检验结果的准确性。适合实验室样品的大批量检测，同时又可以进行确证检测，更适合实验室的实际操作。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂及主要设备

水产品取鱼肌肉部分，混合，匀浆，备用。

乙腈（色谱纯），购自天津市福晨化学试剂厂；中性氧化铝（分析纯，100～200目），购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；乙酸铵（分析纯），购自天津市津科精细化工研究所。

酶标仪MK3由Thermo公司制造；液相色谱质谱联用仪4000Q TRAP由美国应用生物系统公司制造；色谱柱Shim-pack XR-ODSⅢ由日本岛津公司生产；酶联免疫试剂盒由美国Beacon公司生产；氮气吹干仪由天津艾维欧科技发展有限公司制造；微量移液器由Thermo公司制造；中性氧化铝柱（500 mg/3 ml）由美国Waters公司生产。

1.2 ELISA方法

取约5.00 g已均质样品于50ml离心管中，加入10ml乙腈，充分振荡，于4 000r/min离心 5min。加入3 g中性氧化铝，4 000r/min离心5min，移取上清液于10 ml玻璃管中，45℃氮气吹干，加入0.5ml稀释好的试剂a（试剂盒自带），混合，静置30min，称取0.1g试剂b（试剂盒自带）加入到玻璃管中，混合，静置10 min，取50 μl上清液，加入0.95 ml样品稀释液并混匀，供ELISA测定。

1.3 LC-MS/MS方法

1.3.1 LC-MS/MS样品前处理

参照文献[18]方法进行提取和净化进行。

1.3.2 LC-MS/MS测定条件

液相色谱条件：C18色谱柱为50 mm×2 mm，1.6 μm；柱温为40℃；进样量为2 μl；流速为0.25 ml/min；流动相A为1 mmol/L乙酸铵；流动相B为乙腈。

质谱条件：详见表1和表2。

表1 质谱条件

表2 特征离子对

1.4 计算

1.4.1 ELISA结果计算

以标准品百分吸光率的对数为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线图。将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线中读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中隐性孔雀石绿及其代谢物的实际浓度。

1.4.2 LC-MS/MS计算方法

其中：c为由曲线计算得到的样品中隐性孔雀石绿含量，ng/ ml；v为定容体积，ml；m为样品质量，g。

2 结果与讨论

2.1 ELISA试剂盒质量评价

2.1.1 准确度、精密度

采用基质加标实验，依据浓度和吸光度的线性关系绘制标准曲线。根据添加样的检测结果，计算得出试剂盒的准确度和精密度，结果如表3所示。

表3 ELlSA试剂盒准确度和精密度

2.1.2 检出限

对添加不同浓度孔雀石绿的样品进行检测，在浓度小于0.5 μg/kg时，均为未检出。添加浓度在0.5 μg/kg以上时，都可以检出。因此本试剂盒的检出限定为0.5 μg/kg。

2.2 ELISA结果与LC-MS/MS结果比较

经液质检测无隐性孔雀石绿的40个样品中，添加0.5、1.0、1.5和 2.0 μg/kg 4个不同浓度的隐性孔雀石绿标准品，每个浓度做10个添加样。结果表明，ELISA对40个不同浓度添加样的检测中，检测结果均为阳性，并且添加回收率在70%～120%之间。

同时，对这40个样品采用LC-MS/MS进行确证，隐性孔雀石绿标准品的质谱保留时间、特征离子丰度比的比较，得出添加质量浓度在0.5、1.0、1.5和2.0 μg/kg时，样品中隐性孔雀石绿的保留时间、定性离子与定量离子的峰面积比均与标准品一致。说明采用ELISA测得的这40批水产品样品中均含有隐性孔雀石绿，ELISA结果与LC-MS/MS结果相符，能够较准确地检测含有隐性孔雀石绿的阳性水产样品。

3 结论

本实验采用ELISA对水产品中隐性孔雀石绿的检测方法进行研究。浓度在0.5～4.0μg/kg的添加样，回收率为78.2%～110%。通过对阴性对照组的检测，结果全部为阴性，证明ELISA无假阳性。测定ELISA检测限为0.5μg/kg，定量限为1.5μg/kg。通过对阳性对照组的检测，采用与阴性对照组的同一批样品中添加0.5、1.0、1.5和2.0 μg/kg 4个不同浓度的隐性孔雀石绿标准品，LCMS/MS对该结果进行确证。实验结果表明，ELISA结果与LC-MS/ MS结果较为一致，证明ELISA法的准确性。ELISA检测水产品中隐性孔雀石绿，操作简便，检测时间短，成本低，适合实验室水产样品的大批量检测。

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蒙君丽（1973-），女，水产高级工程师，研究方向：为水产品质量安全检测。