扁平苔藓皮损中microRNA-155的表达及与Th17/Treg失衡的相关性

贺 琪 朱 旋 皮先明 石 全 李家文 胡 枫



·论著·

扁平苔藓皮损中microRNA-155的表达及与Th17/Treg失衡的相关性

贺 琪1，3朱 旋2，3皮先明1，3石 全1，3李家文4胡 枫5

目的： 检测microRNA-155(miR-155)在皮肤扁平苔藓(CLP)中的表达，明确其与辅助性T细胞17 /调节性T细胞(Th17/Treg)失衡的相关性。方法： 应用TaqMan探针法检测33例CLP患者和25名健康对照者外周血中miR-155，孤儿受体-γt(RORγt)，白细胞介素-17A(IL-17A)，叉状头/翼状螺旋转录因子P3(Foxp3)和IL-10的基因表达水平。结果： CLP中miR-155，RORγt、Foxp3和IL-17A 的表达较对照组显著升高，而IL-10的表达显著降低(均P<0.05)；CLP组中，miR-155分别与RORγt、Foxp3和IL-17A的含量显著正相关(均P<0.001)，与IL-10的含量无明显相关性(P>0.05)。结论： CLP中的miR-155过表达可能与Th17/Treg失衡有关。

microRNA-155； 扁平苔藓； 辅助性T细胞17； 调节性T细胞； 白细胞介素-17A

micro-RNA(miRNA)在自身免疫病中的作用正逐渐被发现并重视。有学者发现口腔扁平苔藓(oral lichen planus，OLP)患者体内存在microRNA-155(miR-155)表达上调[1,2]和辅助性T细胞17 /调节性T细胞(T-helper 17 cell/regulatory T cell，Th17/Treg)免疫失衡[3]。研究证实miR-155是新型促炎CD4+T细胞亚类Th17细胞和对效应T细胞具有抑制作用的Treg细胞分化增殖的关键调控成分[4]，故本研究应用TaqMan探针法等方法检测miR-155，Th17细胞的标志因子孤儿受体-γt(retinoid-acid receptor-related orphan receptor gamma，RORγt)和主要效应因子白细胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)，以及Treg细胞的标志因子叉状头/翼状螺旋转录因子P3(forkhead box P3，Foxp3)和主要效应因子IL-10在皮肤扁平苔藓(cutaneous lichen planus，CLP)患者外周血中的表达与关联，以探讨miR-155在CLP中的表达及其与Th17/Treg失衡的关系。

1 资料和方法

1.1 研究对象 CLP组外周血标本取材自2014年1月至2016年10月于我院皮肤科就诊的门诊患者，均经临床和病理确诊为CLP，共33例(男18例，女15例，年龄15～65岁，平均38.66±9.36岁)；所有患者均未患其他皮肤病，一个月内未接受系统治疗，两周内未接受局部治疗。对照组外周血标本取材自同期我院健康体检者，共25名(男16名，女9名，年龄19～58岁，平均25.12±10.22岁)，既往体健。本研究已获湖北省中医院伦理委员会批准，并获得所有参与者的知情同意。

1.2 合成引物和探针 依照NCBI数据库的基因序列来设计miR-155和内参U6核内小RNA(small nuclear RNA，snRNA)的引物和探针。miR-155 上游引物5’-GCCGTTAATGCTAATCGTGAT-3’，下游引物5’-TGGGTTCATTTCTGGGTCTT-3’，探针序列FAM-TCTATTCCATTGGTCTACT-MGB，U6 snRNA上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，探针序列FAM-AACGATACAGAGAAGATT-MGB，探针均以各自的下游引物作为逆转录特异性引物，以上由上海捷瑞公司合成。RORγt，Foxp3，IL-17A，IL-10和内参β-actin的引物信息见表1。

表1 人类基因引物列表

1.3 实验方法

1.3.1 TaqMan探针法 应用TaqMan探针实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)法检测miR-155和内参U6 snRNA。用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，按参照总RNA提取试剂盒(宝曼，上海)说明书提取总RNA，应用紫外光分光光度法调整浓度到50 ng/μL。应用TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit(ABI，USA)合成cDNA，反应条件设置为16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。应用TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI，USA)行Real-time PCR操作，阴性对照用去离子水代替cDNA，反应条件设置为95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环，每个标本检测3次。

1.3.2 SYBR Green I染料法 应用SYBR Green I染料qRT-PCR法检测RORγt，Foxp3，IL-17A，IL-10和内参β-actin。提取总RNA的步骤如上文，浓度调整至1 g/L。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，USA)行cDNA合成，采用FastStart Universal SYBR Green MasterRox(Roche，Germany)行Real-time PCR操作，阴性对照用去离子水代替cDNA，反应条件为95℃ 10 min，94℃ 15 s，59℃ 1 min，72℃ 1 min，40个循环，72℃最后延伸5 min。每个标本检测三次。所有PCR检测结果使用ABI 7500实时荧光定量PCR系统(ABI，USA)行定量分析，用内参进行数据标准化。

2 结果

2.1 miR-155、RORγt、Foxp3、IL-17A和IL-10的表达情况 与对照组相比，miR-155、RORγt、Foxp3和IL-17A在CLP组中的表达水平显著上调，而IL-10的表达显著降低(图1)。

2.2 miR-155，RORγt，Foxp3，IL-17A和IL-10之间的关联 通过对实验结果的统计学分析发现，CLP组中miR-155的表达水平分别与RORγt、Foxp3和IL-17A的含量显著正相关，RORγt与IL-17A的表达呈显著正相关(图2)；而IL-10与miR-155、RORγt、Foxp3和IL-17A的表达均无明显相关性(r=-0.106，r=-0.095，r=0.223，r=-0.017，均P>0.05)。

图1 a:TaqMan探针法检测miR-155在对照组和CLP组中的基因表达水平；b:SYBR Green I染料法检测RORγt、Foxp3、IL-17A和IL-10在对照组和CLP组中的基因表达水平

图2 a：CLP组中，miR-155与RORγt的基因表达水平之间的相关性；b:CLP组中，miR-155与Foxp3的基因表达水平之间的相关性；c:CLP组中，miR-155与IL-17A基因表达水平之间的相关性；d:CLP组中，RORγt与IL-17A基因表达水平之间的相关性

3 讨论

CLP是一种丘疹鳞屑性发疹性皮肤病，其发病涉及感染、免疫、精神等诸多因素。miRNA是一类包含18-25个核苷酸的非编码小分子RNA，在哺乳动物中含量丰富，能在转录后水平上对mRNA进行关键性负调控[5]。有学者报道miR-155在OLP患者外周血和皮损中表达升高[1,2]，本研究发现miR-155在CLP患者外周血中的表达亦显著上调，提示miR-155的异常表达与CLP的发病有关，然而其具体功能和机制尚不清楚。

本次研究的结果显示RORγt，Foxp3和IL-17A在CLP患者外周血中表达均显著上调，而IL-10的含量明显下调，这几种因子在CLP中的表达情况与此一致[3,6,7]，提示Th17细胞和Treg细胞皆参与了LP的发病，在患者体内异常增殖，且疾病进程中存在Th17细胞功能亢进和Treg细胞功能受损。本研究的统计学分析发现，CLP患者外周血中miR-155的含量与RORγt，Foxp3和IL-17A的含量均呈显著正相关，而IL-10的含量与miR-155、RORγt、Foxp3和IL-17A的表达水平皆没有明显相关性，提示CLP中的miR-155过表达与Th17细胞和Treg细胞的异常增殖及Th17功能亢进有关，而Treg细胞功能受损与miR-155和Th17细胞的数量和功能变化无直接关联。

文献报道小鼠脾脏CD4+T细胞高表达miR-155可致RORγt和Foxp3表达上调，IL-17含量升高，而对CD4+T细胞抑制miR-155的表达则出现与上述相反的实验结果，另一方面Treg细胞的主要效应因子IL-10和TGF-β1的含量不受miR-155表达变化的影响[4]，本研究的统计结果与以上基本一致。有学者发现Treg等免疫细胞分泌的IL-10能够阻止Th17细胞分泌IL-17，进而抑制Th17介导的免疫炎症[8]。因此可以推测，CLP中高表达的miR-155促使Th17细胞和Treg细胞分化增殖以及IL-17分泌增加，但对IL-10的分泌没有明显影响，同时CLP中IL-10表达显著下调，故无法有效抑制Th17细胞介导的炎症，致使Th17/Treg失衡出现或加重，疾病发生或发展。

综上所述，CLP中存在外周血miR-155过表达，与Th17细胞和Treg细胞分化增殖以及Th17功能亢进有关，与Treg功能无关，可能涉及Th17/Treg失衡的调控。本研究首次探讨CLP中miR-155的表达与Th17/Treg失衡的关系，为CLP的发病机理和miR-155的功能机制提供了新的理论和实验依据，为CLP的靶向治疗提供了新思路。但仍存在许多问题，例如CLP中miR-155的具体作用和机理，与Th17/Treg失衡的具体关联和机制，IL-10异常表达的机制及其对Th17/Treg失衡和免疫炎症的具体影响等，均有待进一步研究探讨。

[1] 梁雪艺, 胡靖宇, 周刚. miR-155、miR-146a 在口腔扁平苔藓患者外周血和组织中的变化与相关性研究[J]. 上海口腔医学,2015,24(6):729-734.

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[4] Yao R, Ma YL, Liang W, et al. MicroRNA-155 modulates Treg and Th17 cells differentiation and Th17 cell function by targeting SOCS1[J]. PLoS One,2012,7(10):e46082.

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(收稿：2017-01-05 修回：2017-02-15)

Expression of microRNA-155 and the relationship with imbalance of Th17/Treg in the patients with lichen planus

HEQi1，3,ZHUXuan2，3,PIXianming1，3,SHIQuan1，3,LIJiawen4,HUFeng5.

1.DepartmentofDermatology,HubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430061,China; 2.DepartmentofUrology,HubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430061,China; 3.HubeiProvinceAcademyofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430074,China; 4.DepartmentofDermatology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China; 5.DepartmentofDermatology,WuhanFirstHospital,Wuhan430030,China

HEQi,E-mail:catty0004@163.com

Objective: To detect the expression level of microRNA-155 (miR-155) and to determine the relationship with the imbalance of T-helper 17 cell/regulatory T cell (Th17/Treg) in the patients with cutaneous lichen planus (CLP). Methods: The expression of miR-155, retinoid-acid receptor-related orphan receptor gamma (RORγt), interleukin-17A (IL-17A), forkhead box P3 (Foxp3) and IL-10 in peripheral blood of 33 patients with CLP and 25 normal controls were detected by TaqMan probe. Results: Compared with the normal controls, the expression levels of miR-155, RORγt, Foxp3 and IL-17A were higher and the level of IL-10 expression was lower in the CLP patients with CLP (P<0.05). The level of miR-155 expression was positively correlated with the expression levels of of RORγt, Foxp3 and IL-17A in the patients with CLP (Ps<0.001). There was no correlation between the expression level of miR-155 and IL-10. Conclusion: The miR-155-upregulation existed in the CLP patients may be associated with the imbalance of Th17/Treg.

microRNA-155; lichen planus; T-helper 17 cell; regulatory T cell; interleukin-17A

武汉市科技局青年科技晨光计划项目 (编号：2015071704011621) 国家自然科学基金项目(编号：81502735)

1湖北省中医院皮肤科，武汉，430061 2湖北省中医院泌尿外科，武汉，430061 3湖北省中医药研究院，武汉，430074 4华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科，武汉，4300225武汉市第一医院皮肤科，武汉，430030

贺琪,E-mail: catty0004@163.com