拟南芥醇腈酶基因在大肠杆菌中的表达优化及酶学性质分析

缪江林静洪裴晓林俞冰

1.浙江中医药大学 杭州 310053 2.杭州师范大学

拟南芥醇腈酶基因在大肠杆菌中的表达优化及酶学性质分析

缪江1林静洪2裴晓林2俞冰1

1.浙江中医药大学 杭州 310053 2.杭州师范大学

[目的]优化重组醇腈酶在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达工艺，考察其酶学性质。[方法]基于密码子的偏好性，对拟南芥(Arabidopsis thaliana)醇腈酶基因进行密码子优化，克隆该基因到表达载体pET-28a(+)上，构建重组质粒pET-28a(+)-HNL-At。采用单因素法优化表达工艺，Ni柱亲和层析纯化目的蛋白，紫外荧光光度法考察酶学性质。[结果]通过IPTG诱导成功实现来源于拟南芥醇腈酶基因在大肠杆菌中的重组表达，对诱导条件优化后，发酵液中重组酶活力达到29.3U·mL-1，较未优化前提高68%。通过Ni柱亲和层析对目的蛋白进行纯化，经SDS-PAGE分析重组醇腈酶相对分子质量约为30kDa。通过酶学性质分析，最适反应pH为5，最适反应温度为30℃，比酶活为213.9U·mg-1。[结论]实现重组醇腈酶在大肠杆菌中的高效表达，优化工艺简单可行，酶学性质表征正确，为进一步的酶法制备手性氰醇类化合物奠定基础。

拟南芥；醇腈酶；大肠杆菌；表达优化；酶学性质

醇腈酶又称羟氰裂解酶 (Hydroxynitrile Lyases, HNLs)，在自然界中来源广泛，能可逆地催化HCN和醛酮类化合物生成手性氰醇化合物[1]。手性氰醇化合物是一类关键的中间体，被广泛应用于常山碱和喜树碱、抗菌药甲砜霉素、杀虫剂拟除虫菊酯等手性药物和农药中间体的合成[2-4]。Beate[5]等报道Prunus amygdalus HNL(PaHNL)催化合成(R)-2,2-二甲基-1-氰基丙二醇，产率100%，对映体过量(enantiomeric excess,ee)达97%以上。Manuel[6]等报道Hevea brasiliensis HNL(HbHNL)催化合成(S)-1-[2-(二甲胺)-1-(4-甲氧苯基)乙基]环己醇，其ee达99%以上。Christoph[7]等报道Manihot esculenta HNL(MeHNL)催化合成(S) -4-甲氧基苯乙醇腈，ee达96%。以醇腈酶作为催化剂，合成(R)或(S)型手性氰醇，具有催化效率高、反应条件温和、产率和光学纯度高、底物适用范围广等特点，受到越来越多的关注[8]。

Jennifer[9]等从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现一个新型的醇腈酶，它是α/β水解酶家族的第一个(R)选择性的醇腈酶。与HbHNL和MeHNL序列比对显示，Arabidopsis thaliana HNL（AtHNL）和前者有70%的序列相似性和45%~47%的序列同源性。Kathrin[10]等报道AtHNL催化合成(R)苯乙醇腈，产率100%，ee达98%以上。Danie[11]等报道AtHNL催化合成(R)-2-氯代苯乙醇腈，产率100%，ee达99%以上。在自然界中，醇腈酶在植物中的表达量非常低，需要复杂的纯化工艺才能获得目的酶蛋白[13]。因此，本文拟通过基因重组技术，构建来源于拟南芥其醇腈酶基因的表达载体，通过诱导工艺的优化，实现其在大肠杆菌中的过量功能表达。同时，采用亲和层析色谱法纯化获得重组蛋白，对其酶学性质进行系统表征。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种和质粒 E.coli DH5α，E.coli BL21(DE3)，pET-28a(+)由杭州师范大学生物催化实验室保存。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶 BamHI(批号KB3403BA)、XhoI(批号：CK2101C)、DNA marker(批号A1101A)、protein marker(批号：C2001B)、T4DNA连接酶(批号：K6601AA)由Takara公司提供；质粒和胶回收试剂盒购自爱思进公司 (批号：01216KA1)；PCR清洁试剂盒(批号EP101-01)购自北京全式生物技术有限公司；(D)-扁桃腈(批号：547YL-FB)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；其它试剂均为市售分析纯试剂。

1.1.3 培养基配制 LB培养基（质量分数）:胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，琼脂粉2%（固体培养基用）；pH 7.0。LB培养基用于培养重组大肠杆菌，使用时添加卡那霉素终浓度至50μg·mL-1。

1.2 实验方法

1.2.1 HNL基因的克隆 基于拟南芥醇腈酶基因序列设计引物：上游引物5’-CGGGATCCATGGAACGCAAACATCATTTTGTG-3’(含BamHI位点)，下游引物5’-CCGCTCGAGTTACATATAATCTGTAGCAATAGCGCTT-3’(含XhoI位点)。PCR反应条件为：98℃变性2min；再接着98℃ 10s，58℃ 5s，72℃ 5s，30个循环；最后72℃延伸5min。PCR引物由上海生工合成，PCR产物跑胶验证并切胶回收。

1.2.2 重组表达质粒的构建 PCR产物经双酶切(BamHI和XhoI)，再与质粒pET-28a(+)在22℃连接1h；采用热激法将重组质粒转入E.coli DH5α感受态，在含Kan抗性平板上筛选转化子，挑选阳性转化子送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。经测序鉴定正确后，再将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)，重组质粒命名为pET-28a(+)-HNL-At，菌种保藏至-80℃冰箱。

1.2.3 醇腈酶活力的测定 醇腈酶可催化(D)-扁桃腈裂解为苯甲醛和氢氰酸，前者在280nm处有很高的吸收峰[14]。测定醇腈酶酶活力反应体系：0.7mL 50mmol· L-1乙酸缓冲液(pH 5.5，酶溶解其中)，0.2mL 50mmol· L-1柠檬酸-磷酸缓冲液(pH 3.5，含67mmol·L-1(D)-扁桃腈)，0.1mL酶液，反应中底物终浓度为13.4mmol· mL-1，室温下反应1min，采用紫外分光光度计(DU730，Beckman)测定吸光度，检测波长为280nm，即ΔA，每个数据重复测3次。以不含酶液的反应体系为对照(ΔA′)。酶活定义：1min(D)-扁桃腈经醇腈酶催化生成1μmol苯甲醛酶的量定义为1U。

1.2.4 诱导表达和条件优化 将工程菌接种于10mL LB培养基(含Kan抗性)中，37℃，220r/mim震荡培养12~16h。取培养的菌液，按1%的接种量接种于三角瓶含有100mL LB培养基中，37℃，220r/mim震荡培养2~3h，至合适的OD600(一般为0.6)，分别对诱导强度(0.168、0.336、0.504、0.672、0.840、1.008mmol·L-1)，诱导温度(18℃、22℃、26℃、30℃、33℃、37℃)，诱导时间(3h、6h、9h、12h、15h)和诱导时机(OD6000.3、OD600=0.6、OD600=0.9、OD600=1.2)进行优化。

1.2.5 重组HNL的纯化 用结合缓冲液(Binding Buffer)(20mmol·L-1pH 7.5磷酸钠缓冲液，500mmol· L-1NaCl，50mmol·L-1咪唑)重悬静息细胞，置于冰浴中，采用超声进行细胞破碎。12000×g离心20min，收集细胞破壁上清液，经0.22μm滤膜过滤。采用Ni亲和层析柱(Ni-chelating column)进行蛋白纯化流程：用10倍柱体积Binding Buffer平衡柱子，再将30mL破壁上清液缓缓上样，上样完成后停留1h；10倍柱体积Binding Buffer洗去没有结合的杂蛋白，流出液留样；用洗脱液缓冲液(Elution Buffer)(20mmol·L-1pH 7.5磷酸钠缓冲液，500mmol·L-1NaCl，250mmol·L-1咪唑)收集目的蛋白，流出液留样。Bradford法测定蛋白浓度，采用SDS-PAGE分析重组HNL的表达和纯化过程。

1.2.6 最适pH值 底物 (D)-扁桃腈在pH分别为3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的缓冲溶液中，按酶活测定方法测定酶活，计算相对酶活力。

1.2.7 最适反应温度及热稳定性 纯化后的HNL在不同温度：15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，测定最适反应温度，并在30℃、40℃、50℃、60℃下进行保温，每隔30min检测剩余酶活。计算相对酶活力。

1.2.8 动力学参数Km和Vmax值测定 底物(D)-扁桃腈在pH5.5缓冲液下分别配成不同浓度：0.743、0.867、1.040、1.300、1.733、2.600、5.200、10.400μmol·mL-1。在最适反应条件下，按酶活测定方法测定酶活。做双倒数图，计算Km和Vmax值。

2 结果

2.1 重组HNL表达质粒的构建和验证 以质粒pET-24a(+)-HNL-At（实验室保藏）为模板，PCR扩增得到特征DNA片段，大小为777bp，与目的HNL基因大小相符，结果(图1-A)。与pET28a(+)连接获得重组HNL表达质粒pET-28a(+)-HNL-At。测序结果显示，重组质粒pET-28a(+)-HNL-At中HNL基因序列与目的基因序列相似度为100%。表达质粒pET-28a(+)-HNL-At经双酶切验证所示，获得5329bp和774bp的两条带，结果（图1-B）。该重组质粒转化E. coli BL21(DE3)获得基因工程菌。经初步诱导表达，该基因工程菌显示出明显的醇腈酶活力，进一步证明重组质粒pET-28a(+)-HNL-At的正确性。

图1 PCR产物的验证，重组质粒pET-28a(+)-HNL-At的酶切验证Fig.1 Identification of PCR products,enzyme digestion of recombinant plasmid pET-28a(+)-HNL-At

2.2 工程菌的表达条件优化

2.2.1 诱导强度对重组蛋白表达的影响 取培养的菌液，按1%转接于50mL培养基中，于37℃扩大培养至OD600=0.6，诱导温度为18℃。加异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)终浓度分别至0.168、0.336、0.504、0.672、0.840和1.008mmol·L-1；诱导12h后测细胞干重，静息细胞经超声波破碎后测粗酶活，结果（图2-A）。IPTG能有效提高外源基因的表达，IPTG诱导终浓度为0.504mmol·L-1时，酶活最高。

2.2.2 诱导温度对重组蛋白表达的影响 取培养的菌液，按1%转接于50mL培养基中，于37℃扩大培养至OD600=0.6，加IPTG终浓度至0.504mmol·L-1，分别在18℃、22℃、26℃、30℃、33℃，37℃诱导12h。诱导后测细胞干重，静息细胞经超声波破碎后测酶活，结果（图2-B）。高温和低温都不利于醇腈酶可溶表达，30℃是该酶最适合的诱导温度。

2.2.3 诱导时间对重组蛋白表达的影响 取培养的菌液，按1%转接于50mL培养基中，于37℃扩大培养至OD600=0.6，诱导温度为30℃，IPTG终浓度0.504mmol· L-1，分别诱导3h、6h、9h、12h、15h，诱导完后测细胞干重，结果显示诱导6h时酶活最大（2-C）。在诱导前期，酶活随诱导时间增加而上升，6h后酶活趋于稳定。

2.2.4 诱导时机对重组蛋白表达的影响 取培养的菌液，按1%转接于50mL培养基中，于37℃扩大培养至OD600=0.3、OD600=0.6、OD600=0.9，OD600=1.2时开始诱导6h，诱导温度为30℃，IPTG终浓度0.504mmol·L-1诱导完成后测细胞干重。由图2-D可知，诱导时机为OD600=0.9时，酶活最高。

2.3 HNL蛋白的表达和纯化 按优化后的条件，取培养的菌液，按1%转接于600mL培养基培养至OD600=0.9，加IPTG至终浓度为0.504mmol·L-1，30℃诱导6h。4℃收集的菌体，去离子水清洗1~2次，取超声波破碎后的上清，按1.2.3所述方法测粗酶活。上清经0.22μm滤膜过滤后，按1.2.5所述方法缓慢上样Ni柱亲和层析纯化。所得产物经脱盐处理，冷冻干燥得到纯化醇腈酶。如图3所示，SDS-PAGE验证得到1条30kDa左右的条带，与目的蛋白大小相符合。

图2 不同诱导条件对粗酶活的影响Fig.2 Effects of different induction conditions on enzyme activity

图3 重组醇腈酶SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant Hydroxynitrile lyase

2.4 纯化后HNL的最适pH 纯化后的HNL的最适pH，结果(4-A)。测得HNL最适反应pH为5.0，该酶在弱酸中依然有酶活；但是由于底物在中性及弱碱性中存在较强的自分解，故将考察酶的最适反应pH及酸碱稳定性范围设置在pH 3.0~7.0。pH 4.5~ 6.0之间，该酶有较好的活力，pH 5.0时，HNL比酶活达到最大。

2.5 纯化后HNL的最适反应温度及热稳定性 纯化后的HNL的最适反应温度及热稳定性，结果（图4-B）（图4-C）。在pH5.0时，测得不同反应温度下HNL的比酶活大小，最适反应温度为30℃。酶的热稳定较好，30℃、40℃、50℃保温2.5h，依然有很高的活力，60℃保温时，酶活半衰期为1.5h左右，6h后基本丧失活力。该酶在60℃以下，有较好的热稳定性。

2.6 纯化后HNL的动力学参数Km和Vmax值为了观察HNL对底物的特异性，通过非线性回归方程计算出了HNL的米氏常数 Km值及最大反应速率 Vmax，结果（4-D）。当酶活力为最高酶活一半时所对应的底物浓度为 0.476mmol-1，即 Km值为0.476mmol-1，Vmax为0.245μmol·mL-1·min-1。

图4 HNL酶学性质表征结果图Fig.4 Results of enzymetic properties on HNL

3 讨论

据报道，大约200种植物含有HNLs活性，主要来源于高等植物，如橡胶树、杏树、木薯和高粱属植物等[8]。目前，仅纯化和表征了18种不同来源的HNLs蛋白，表现出不同的氨基酸序列和酶学性质[7,15-16]。根据醇腈酶蛋白是否依赖黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)可分为两类：氧化还原酶类和α/β水解酶类[8,18]。依赖FAD的HNLs主要来源于蔷薇科梅属和苹果属，李亚科，有PaHNL，PmHNL，PsHNL等。此类HNLs的氨基酸序列和氧化还原酶、Zn2+-依赖醇脱氢酶具有较高的同源度，而且在N-端含有序列高度保守的FAD的结合域[19]。研究发现，辅酶FAD并不直接参与氧化还原反应，但具有稳定酶结构的作用，缺乏辅酶FAD会引起酶的失活[8]。另一类FAD非依赖HNLs属于α/β水解酶类，主要分布于亚麻科、禾本科、铁青树科、大戟科中，有MeHNL，HbHNL，AtHNL等；其中AtHNL是此类中的(R)型醇腈酶。该类酶活性位点位于蛋白质内部，通过侧面非极性残基的狭窄通道和外面环境相连接，含有催化三联体：Ser80-His235-Asp207(HbHNL)，Ser80-His236-Asp208(MeHNL)和 Ser81-His236-Asp208(AtHNL)，此类醇腈酶遵循亲核反应机制，其中丝氨酸使底物氰醇去质子化，组氨酸使产物氰根离子质子化，从而完成氰醇的水解反应[8,20-21]。

手性氰醇中含有羟基和氰基官能团，作为手性药物的重要前体砌块，可转化为α-羟基酯、α-羟基酸、α-羟基醛、β-羟基酰胺等具有光学活性化合物，如图5所示[22-27]。

图5 氰醇的合成及其在化学合成中的应用Fig.5 Cyanohydrin synthesis and its application in chemical synthesis

为了提高Arabidopsis thaliana醇腈酶基因的活性，选择质粒pET-28a(+)作为构建载体，本文研究了该基因在Escherichia coli细胞中的表达。基于密码子优化，通过克隆Arabidopsis thaliana醇腈酶基因，得到了HNL的编码基因，其开放阅读框（open reading frame,ORF）长777bp，编码一个含258个氨基酸的酶蛋白。另外，在N端加上6×His标签便于分离纯化目的蛋白。Ni柱亲和层析是实验室蛋白分离纯化的常用方法，具有操作简便，高效等特点[28]。Ni2+能与目的蛋白中His-tag特异性结合，将目的蛋白吸附在鳌合了Ni2+的填料上，而不含His-tag的杂蛋白就会随Binding Buffer流出[29]。

在表达工艺的优化中，通过固定其他因素，依次考察不同诱导强度、诱导温度、诱导时间，诱导时机对HNL蛋白表达的影响。确定诱导强度和诱导温度是影响目的蛋白的表达的主要因素。IPTG与异乳糖的作用相同，对重组菌表达有较大影响，考虑到低浓度时可容蛋白表达量少，高浓度IPTG可能对细胞有毒性，最终选择0.504mmol·L-1的IPTG终浓度。温度较低对大肠杆菌的生长不利，菌体的数量少导致蛋白表达少，酶活也相应减小。温度较高有利于菌体生长，但是合成速度太快，以至于蛋白来不及正确的折叠，部分蛋白以包涵体的形式出现。本实验主要研究可溶性蛋白的表达情况，所以诱导温度选择为30℃。实验表明，随诱导时间增长，酶活上升到最大后逐渐稳定，可能是诱导进入平台期，也可能是发酵液中产生抑制酶表达的物质；从节约实验周期考虑，选取6h作为最适的诱导时间。OD600过大会产生菌种老化现象，不利于重组菌的健康生长和传代，最终选择OD600=0.9作为诱导时机。冻干酶粉进行酶学表征，测得酶最适pH为5，低pH能抑制酶的活性，这可能跟酶活性位点及活性口袋周围的结构有关。该酶的最适温度与热稳定与报道的其他来源的醇腈酶较为接近，具有良好的热稳定性。Km和Vmax值测定，一般在底物浓度较低时进行,酶和底物的匹配程度是影响动力学参数Km和Vmax值的主要因素之一。不同酶源或不同底物的Km和Vmax值相差较大[8]。

国内外已有许多关于HNLs的报道：不同的酶源已经实现在大肠宿主和酵母宿主中表达，酶学性质相差较大。Jennifer[9]等人从15L培养中，分离得到1.75Kg菌体，经测定AtHNL粗酶活约2.300U·mg-1。Ken-ichi[29]等分离纯化得到AtHNL比酶活为99.5U· mg-1。Daniel[30]等对AtHNL基因在大肠肝菌中进行表达，比酶活达到227U·mg-1。本研究通过单因素实验法优化工艺后，以(D)-扁桃腈为底物得到的上清液酶活最高达到29.3U·mL-1，较未优化前提高68%，比国外水平有较大提高。另外，粗品中有本底表达的杂蛋白，也可能含有抑制酶活的物质，经过Ni柱亲和层析纯化得到纯度较高的醇腈酶，比酶活可达到213.9U· mg-1，比国外水平有提高。该酶的高效表达及酶学性质的表征，为合成手性氰醇提供了基础，这也是下一步工作的重点。

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Efficient Expression of Hydroxynitrile Lyase from Arabidopsis Thaliana in Escherichia Coli and Analysis of Recombinant Hydroxynitrile Lyase Enzymetic Proerties

MIAO Jiang1,LIN Jinghong2,PEI Xiaolin2,et al
Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]To optimize the technology of heterologous expression of AtHNL in Escherichia coli,and investigated its enzymetic properties.[Method]Based on the bias of codon,we optimized the codon of HNL gene from Arabidopsis thaliana,and the fragment of HNL gene was amplified by PCR.Using pET-28a(+)as vector,the recombinant plamisd pET-28a(+)-HNL-At was constructed.Optimization of heterologous expression level was enhanced by single factor experiment method,the recombinant protein was purified by Ni-chelating column.Investigated the activity of AtHNL by UV.[Results]Recombinant HNL was successfully expressed in Escherichia coli by IPTG,the maximum activity of AtHNL was reached 29.3U·mL-1in the fermentation broth,promoted to 68%compared with unoptimization.Then,the protein was purified by Ni-chelating column,SDS-PAGE analysis showed that the molecular weight of the AtHNL was 30kDa.The optimal activity was determined at pH 5.0 and 30℃ was 213.9U·mg-1.[Conclusion]Recombinant HNL was expressed highefficiently in Escherichia coli,and the expression technology was simple and feasible.The properties of recombinant HNL were correct,which provided the reliable foundation to further enzymatic preparation of chiral cyanohydrins.

Arabidopsis thaliana;Hydroxynitrile lyase;Escherichia coli;expression optimization;enzymetic properties

R282.71

：A

：1005-5509（2017）05-0408-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.05.015

2016-12-26）

中国博士后科学基金(163936)

Fund project:China postdoctoral scientific foundation(163936)

俞冰，E-mail:zjtcmyubing@126.com