DMOG对MSCs成骨分化及缺血损伤影响的研究

葛婷婷 余勤 祝莉 周丽萍

浙江中医药大学生命科学学院 杭州 310053

DMOG对MSCs成骨分化及缺血损伤影响的研究

葛婷婷 余勤 祝莉 周丽萍

浙江中医药大学生命科学学院 杭州 310053

[目的]研究二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalglycine，DMOG）对体外培养的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成骨分化和缺血损伤的影响。[方法]利用全骨髓贴壁法获得MSCs，诱导其向成骨细胞分化，同时给予20μM、40μM、80μM的DMOG处理，培养3d、7d、14d时分别进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的定量测定，培养14d时进行硝酸银染色；建立MSCs缺血损伤模型，同时给予不同浓度DMOG处理，Western blot检测MSCs中Bcl-2/Bax蛋白的表达，MTT法检测MSCs增殖能力，台盼蓝染色检测MSCs细胞活力。[结果]DMOG处理可促进MSCs成骨分化中ALP的表达，且DMOG 20μM处理促进作用最显著；各组MSCs成骨分化中ALP的表达均呈时间依赖性增加。DMOG 20μM组黑色矿化基质分泌明显多于其余各组。40μM DMOG可以显著提高缺血损伤MSCs中Bcl-2蛋白的表达、抑制Bax蛋白的表达，可显著促进缺血损伤MSCs的增殖能力和存活率，DMOG的20μM、80μM处理无显著促进或抑制作用。[结论]DMOG 20μM可显著促进MSCs成骨分化能力，DMOG 40μM可有效提高缺血损伤MSCs的增殖能力和存活率。

MSCs；DMOG；成骨分化；缺血损伤；细胞凋亡

股骨头坏死是由多种原因引起的股骨头缺血性破坏或骨细胞变性导致整个髋关节功能丧失的一类临床常见骨科疾病，致残性高[1-2]，多数患者不得不进行人工关节置换，寻求保存患者自身关节的有效治疗方法实有必要[3]。近年来，随着人们对间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs）成骨分化作用认识的深入，为股骨头坏死的治疗提供了一种新的选择。但是，MSCs移植后的生存环境恶劣，需要借助药物加强MSCs的成骨分化能力并提高其移植后存活率，因而本课题通过研究二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalglycine，DMOG）对MSCs成骨分化能力的影响，以及通过建立MSCs缺血损伤模型，明确不同浓度DMOG对MSCs缺血损伤的影响，有望为DMOG联合MSCs治疗股骨头坏死疾病提供一定的理论依据和实验基础。

1 材料

1.1 实验动物 SD大鼠，清洁级，雄性，体质量为（60～80）g，浙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 主要试剂 DMEM/F-12培养基（Invitrogen公司，批号：12400-024），胎牛血清（FBS，GiBco公司，批号：10099-141），0.25%胰蛋白酶-1mmoL EDTA（Invitrogen公司，批号：25300054），青-链霉素（Invitrogen公司，批号：10378016），Triton X-100裂解液（Biosharp公司，批号：BS363A），多聚甲醛（天津市化学试剂研究所，批号：980227），硝酸银、硫代硫酸钠（Sigma公司，批号：S8157、72049），台盼蓝染料、MTT（Amresco公司，批号：K940、0793），二甲基亚砜(北京鼎国生物技术有限公司，批号：DH105-9)、DMOG（Cayman公司，批号：71210），成骨分化培养基（广州赛业生物技术有限公司，批号：RASMX-90021），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性检测试剂盒（联科生物技术有限公司，批号：AP0013），兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体（联科生物技术有限公司，批号：ab36715），兔抗大鼠Bax单克隆抗体（联科生物技术有限公司，批号：ab689），兔抗大鼠β-actin单克隆抗体（联科生物技术有限公司，批号：ab008），HRP标记的山羊抗兔二抗（联科生物技术有限公司，批号：GAR0072）。

1.3 主要仪器设备 倒置相差显微镜（TE2000-S，Nikon公司），电热鼓风干燥箱（VBLC310，美国Heraeus公司制造），纯水仪（PN PAL-CAXXXLSM2，美国PALL公司），超净工作台（SW-CF-2FD，苏州净化设备有限公司），二氧化碳培养箱（3111，美国FORMA公司），电子天平（ARA-520，Adventurer），离心机（LDZ5-2型，北京医用离心机厂），高压灭菌锅（YXQ-LS-50A，上海云泰仪器代表有限公司），冰箱（BCD-216E/B，Haier），酶标仪（SpectraMax 190，美国MD公司），台式高速冷冻离心机（3K-15，德国Sigma公司），超声波细胞粉碎机（JY92-IIDN，宁波新芝生物科技股份有限公司），脱色摇床（TS-1型，海门其林贝尔仪器制造有限公司）。

2 方法

2.1 MSCs的体外分离培养 将SD大鼠脱颈处死，用75%的乙醇浸泡消毒2min；无菌条件下解剖大鼠，取出股骨、胫骨，剔除骨上附着的软组织，用5mL PBS液将骨髓冲出，1000r/min离心5min；加入含10% FBS、1%青-链霉素的DMEM/F-12培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱培养；24h后换液，弃去未贴壁的细胞；随后每2~3d换1次液，待细胞融合至80%~90%，结束原代培养。取出细胞融合接近80%~90%的培养瓶，弃去旧培养液，PBS清洗，用2mL 0.25%胰蛋白酶-1mmoL EDTA消化3~5min，待细胞形态开始皱缩变圆，间隙变宽时加等量的含有10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞于离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，加入含10%FBS、1%青-链霉素的DMEM/F12培养基5mL轻轻吹打细胞，制成细胞悬液，将细胞以1×105个/mL接种于培养瓶中进行传代培养。

2.2 MSCs成骨诱导分化、分组及DMOG干预 将P3代MSCs以1×104个/mL接种于6孔板中，每孔接种2mL细胞悬液，24h后将MSCs的培养基更换为含不同浓度DMOG的成骨诱导分化培养基，根据不同浓度的DMOG实验分为4组：正常组、DMOG 20μM组、DMOG 40μM组、DMOG 80μM组，各组每3d更换1次培养基，诱导分化14d。

2.3 ALP定量测定 分别在成骨诱导分化分组换液培养3d、7d、14d后，收集细胞并以0.05%的Triton X-100裂解液进行裂解。按照ALP活性检测试剂盒说明书测定，取50μL的裂解物于96孔板中，再加50μL显色底物混匀，37℃避光孵育 5min，加入100μL终止液终止反应，在405nm处检测各组样品的吸光度，每组设3个复孔，通过标准曲线进行计算各组细胞ALP活力。

2.4 硝酸银染色 在成骨诱导分化分组换液培养14d后，吸干成骨诱导分化各组6孔板内的培养液，用4%的多聚甲醛固定15min，双蒸水洗2次，自然晾干后，每孔加入2mL新配制的2%硝酸银溶液染色5min，用去离子水充分洗涤后，放置于紫外线下照射15～30min，双蒸水漂洗2次，再用5%硫代硫酸钠处理2min，双蒸水洗2次，倒置相差显微镜下观察。

2.5MSCs缺血损伤模型建立、分组及DMOG干预 取P3代MSCs细胞悬液5mL（1×105个/mL）接种于25cm2培养瓶内。培养过夜，待细胞贴壁后，用PBS洗涤3次，更换培养基为无血清且含不同浓度DMOG的DMEM/F12培养基继续培养，建立MSCs缺血损伤模型。实验共分为3组：正常组（用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养）、缺血清组（用无血清的DMEM/F12培养基培养）、不同浓度DMOG干预组（在无血清DMEM/F12培养基中加入DMOG使其终浓度分别为20μM、40μM、80μM培养）。

2.6 Western blot检测MSCs中Bcl-2/Bax蛋白的表达 缺血清培养MSCs 24h后，提取各组细胞蛋白。BCA法测定蛋白浓度，变性后上样，以10%分离胶、5%浓缩胶的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，常规方法转膜，5%脱脂奶粉封闭1h，分别加兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体(1∶1000稀释)，兔抗大鼠Bax单克隆抗体（按1∶1000稀释）或兔抗大鼠β-actin单克隆抗体（1∶5000稀释），4℃孵育过夜，HRP标记的山羊抗兔二抗室温孵育1.5h，曝光显影。

2.7 MTT法检测MSCs增殖能力 将MSCs(1×104个/mL）接种96孔板内，待细胞贴壁后，按照“2.5 MSCs缺血损伤模型建立、分组及DMOG干预”方法分为正常组、缺血清组、不同浓度DMOG干预组。分别在培养1d、3d、5d、7d时，弃上清，每孔加入20μL浓度5mg·mL-1的MTT，37℃孵育4h，小心吸弃孔内上清，每孔加入150μL DMSO溶液，待充分溶解后，在酶标仪上测量490nm处OD值，每组设5个复孔，按下列公式计算其平均OD值。

OD490-均=（OD490-1+OD490-2+OD490-3+OD490-4+OD490-5）/5（公式1-1）

2.8 台盼蓝染色检测MSCs活力 正常组、缺血清组、不同浓度DMOG干预组各组细胞培养3d时分别制备单个细胞悬液，调整至细胞浓度为1×105个/mL。取1滴0.4%台盼蓝溶液和9滴细胞悬液混匀，在3min内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，镜下活细胞拒染，死细胞被染成淡蓝色。按下列公式计算细胞活力：

细胞活力（%）=[（总细胞数-死细胞数）/细胞总数]× 100%（公式1-2）

2.9 统计学方法 利用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据以(±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 不同浓度DMOG处理后MSCs中ALP定量测定结果(±s，U·L-1)Tab.1 The quantitative results of ALP in different DMOG concentration groups(±s,U·L-1)

表1 不同浓度DMOG处理后MSCs中ALP定量测定结果(±s，U·L-1)Tab.1 The quantitative results of ALP in different DMOG concentration groups(±s,U·L-1)

注：同一时间点，与正常组比较，*P<0.05；与DMOG 20μM组比较，△P<0.05；与DMOG 40μM组比较，□P<0.05。同一组内，与3d比较，■P<0.05；与7d比较，☆P<0.05。Note:At the same time,compared with control group,*P<0.05;Compared with DMOG 20μM group,△P<0.05;Compared with DMOG 40μM group,□P< 0.05.In the same group,compared wtih 3d,■P<0.05;Compared wtih 7d,☆P<0.05.

组别正常组DMOG 20μM组DMOG 40μM组DMOG 80μM组诱导分化时间3d 7d 14d 31.46±0.48 35.86±0.45*32.68±0.58*△32.96±0.36*△86.89±2.76■142.55±0.16*■99.12±0.98*△■97.80±22.28*△■122.62±1.75■☆175.98±1.29*■☆166.65±1.42*△■☆140.43±2.14*△□■☆

3 结果

3.1 MSCs形态观察 倒置相差显微镜观察发现，原代培养3d时，可见放射状排列的细胞集落，伸出长短不一、粗细不均的突起，并开始大量增殖（图1A）；原代培养8d时，单个细胞为长梭形，细胞呈漩涡状生长，且细胞密度增大，融合度达到80%~90%（图1B）。传代后的MSCs生长迅速（图1C、图1D），细胞形态主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形，趋向于均一化，且悬浮的杂细胞逐渐减少，说明通过不断的传代和换液MSCs纯度提高。

3.2 不同浓度DMOG处理后MSCs中ALP定量测定结果 实验结果（表1）。诱导分化3d时，与正常组比较，DMOG 20μM组、DMOG 40μM组和DMOG 80μM组ALP活力均显著增加，差异有统计学意义（P<0.05)；与DMOG 20μM组比较，DMOG 40μM组、DMOG 80μM组ALP活力显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与DMOG 40μM组比较，DMOG 80μM组ALP活力差异无统计学意义（P>0.05）。诱导分化7d时，与正常组比较，DMOG 20μM组、DMOG 40μM组和DMOG 80μM组ALP活力差异有统计学意义（P< 0.05）；DMOG的20μM、40μM组、80μM三组之间两两比较，DMOG 20μM组ALP活力最高，差异有统计学意义（P<0.05）。诱导分化14d时，与正常组比较，DMOG 20μM组、DMOG 40μM组和DMOG 80μM组ALP活力显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）；DMOG 20μM、40μM、80μM三组之间两两比较，DMOG 20μM组ALP活力最高，差异有统计学意义（P<0.05）。在同一组内，ALP活力增加呈时间依赖性，诱导分化14d时各组ALP活力均最高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果显示：DMOG处理可促进MSCs成骨分化中ALP的表达，且DMOG 20μM处理促进作用最显著，各组MSCs成骨分化中ALP的表达均呈时间依赖性增加。

图1 大鼠骨髓MSCs形态图（40×）Fig.1 Morphology of rat bone marrow MSCs（40×）

3.3 不同浓度DMOG处理后MSCs成骨分化的硝酸银染色结果 各组细胞成骨诱导分化14d后，硝酸银染色可见细胞间散有黑色颗粒，颗粒大小不一，表明有矿化基质沉淀。图2A、2B、2C、2D分别是MSCs成骨分化正常组、DMOG 20μM组、DMOG 40μM组、DMOG 80μM组的染色情况，结果显示：DMOG 20μM组黑色矿化基质分泌明显多于其余各组。

3.4 不同浓度DMOG处理缺血损伤MSCs中Bcl-2/ Bax蛋白的表达 提取各组细胞蛋白，进行Western blot实验，可见大小26kDa的Bcl-2蛋白，20kDa的Bax蛋白及42kDa的β-actin蛋白（图3C）。对显影结果进行统计分析，与正常组比较，缺血清组、20μM DMOG组、80μM DMOG组Bcl-2蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.01），40μM DMOG组无统计学差异（P>0.05）；与缺血清组比较，20μM DMOG组、40μM DMOG组、80μM DMOG组Bcl-2蛋白表达均显著提高，差异有统计学意义（P<0.01），其中，40μM DMOG组Bcl-2蛋白表达水平最高（图3A）。与正常组比较，各组Bax蛋白表达均显著提高（P<0.01）；与缺血清组比较，20μM DMOG组、40μM DMOG组Bax蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），80μM DMOG组表达水平显著提高，差异有统计学意义（P<0.01），其中，40μM DMOG组Bax蛋白表达水平最低（图3B）。结果显示：40μM DMOG可以显著提高缺血损伤MSCs中Bcl-2蛋白的表达，抑制缺血损伤MSCs中Bax蛋白的表达。

图2 各组MSCs成骨分化硝酸银染色结果图（200x）Fig.2 Von Kossa stain results of MSCs osteogenetic differentiation in each group（200x）

表2 不同浓度DMOG处理对缺血损伤MSCs增殖能力的影响（OD490，n=5，±s)Tab.2 The effects of multiplication capacity of ischemic injury MSCs with different concentration DMOG treated (OD490，n=5，±s)

表2 不同浓度DMOG处理对缺血损伤MSCs增殖能力的影响（OD490，n=5，±s)Tab.2 The effects of multiplication capacity of ischemic injury MSCs with different concentration DMOG treated (OD490，n=5，±s)

注：同一时间内，与正常组比较，*P<0.05；与缺血清组比较，#P<0.05；与20μM DMOG组比较，△P<0.05；与40μM DMOG组比较，□P<0.05。Note:At the same time,compared with control group,*P<0.05;Compared with ischemic injury group,#P<0.05;Compared with 20μM DMOG group,△P<0.05;Compared with 40μM DMOG group,□P<0.05.

时间1d 3d 5d 7d组别正常组 缺血清组 20μM DMOG组 40μM DMOG组 80μM DMOG组0.322±0.008 0.729±0.003 0.839±0.010 0.988±0.010 0.177±0.009*0.206±0.012*0.227±0.014*0.238±0.012*0.177±0.012*0.206±0.018*0.229±0.016*0.236±0.009*0.196±0.009*#△0.221±0.006*#△0.247±0.005*#△0.268±0.005*#△0.176±0.006*□0.208±0.018*□0.232±0.021*□0.242±0.009*□

3.5 不同浓度DMOG处理对缺血损伤MSCs增殖能力的影响 实验结果（表2）。缺血损伤1d、3d、5d、7d时，与正常组比较，缺血清组、20μM DMOG组、40μM DMOG组、80μM DMOG组的OD值均明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与缺血清组比较，20μM DMOG组、80μM DMOG组的OD值均无统计学差异（P>0.05），40μM DMOG组的OD值显著上升，差异有统计学意义（P<0.05）；与20μM DMOG组比较，40μM DMOG组的OD值显著上升，差异有统计学意义（P< 0.05），80μM DMOG组的OD值无统计学差异（P> 0.05）；与40μM DMOG组比较，80μM DMOG组的OD值降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果显示：DMOG 40μM处理可显著促进缺血损伤MSCs的增殖能力，DMOG的20μM、80μM处理无显著促进或抑制作用。

图3 不同浓度DMOG处理缺血损伤MSCs中Bcl-2/Bax蛋白表达水平Fig.3 The expression level of Bcl-2/Bax protein from ischemia injury MSCs in different DMOG concentrations

表3 不同浓度DMOG处理组MSCs的台盼蓝染色结果（±s,%）Tab.3 Trypan blue stain results of MSCs in different DMOG treated groups(±s,%)

表3 不同浓度DMOG处理组MSCs的台盼蓝染色结果（±s,%）Tab.3 Trypan blue stain results of MSCs in different DMOG treated groups(±s,%)

组别正常组缺血清组20μM DMOG组40μM DMOG组80μM DMOG组活细胞比例95.65±0.012 82.74±0.032*83.50±0.106*89.45±0.066*#△83.87±0.086*□

3.6 不同浓度DMOG处理对缺血损伤MSCs活力的影响 各组MSCs培养3d时，进行台盼蓝染色，测定细胞活力，即测定活细胞占细胞总数的比例，结果（表3）。与正常组比较，缺血清组、20μM DMOG组、40μM DMOG组和80μM DMOG组活细胞比例显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与缺血清组比较，20μM DMOG组和80μM DMOG组活细胞比例无统计学差异（P>0.05），40μM DMOG组活细胞比例增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与20μM DMOG组比较，40μM DMOG组活细胞比例明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），80μM DMOG组活细胞比例差异无统计学意义（P>0.05）；与40μM DMOG组比较，80μM DMOG组活细胞比例明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。结果显示：DMOG 40μM处理可显著提高缺血损伤MSCs的存活率，DMOG的20μM、80μM处理无显著促进或抑制作用。

4 讨论

MSCs来自于中胚层，是一类未分化的多能成体干细胞，拥有多向分化的潜力[4]。在体内或体外适宜的条件下具有分化为成骨细胞[5]、心肌细胞[6]、神经细胞[7]、脂肪细胞[8]等多种细胞的能力。MSCs来源广泛，易于提取分离、体外培养、扩增和纯化，不存在伦理问题的争议，所以现已成为组织工程、细胞和基因治疗方面研究的热点，有着可观的应用前景。本课题选择全骨髓贴壁筛选法对MSCs进行培养，并定期换液除去杂细胞，达到纯化细胞的目的。同时，全骨髓贴壁筛选法几乎保留所有的骨髓前体细胞，还提供细胞生长所需的细胞因子，促使细胞更好的生长。

DMOG作为一种小分子酮戊二酸类似物，通过与内源性的2-酮戊二酸竞争从而抑制脯氨酸羟化酶（proline hydroxylase,PHD），使得细胞在正常氧环境下也“感觉”低氧，对动物及人类均无毒性，可作为高效安全的缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）稳定剂。目前，有研究[9-10]表明DMOG在MSCs成骨分化中有一定的促进作用，可能是其作用形成的低氧环境促使细胞向成骨细胞分化，研究同时表明HIF-1在MSCs的成骨分化中发挥重要作用。DMOG作为一种缺氧模拟剂，可以有效降低HIF-1α的降解，稳定HIF-1的表达，从而促进MSCs成骨分化。本课题给予MSCs不同浓度DMOG处理，根据ALP的定量测定可知DMOG处理可促进MSCs成骨分化中ALP的表达，且DMOG 20μM处理促进作用最显著；各组MSCs成骨分化中ALP的表达均呈时间依赖性增加。同时，硝酸银染色结果也显示，在DMOG的给药浓度为20μM时，矿化基质沉淀最多，表示DMOG 20μM的给药浓度能有效促进MSCs的成骨分化。

研究表明，DMOG与HIF-1α关系密切，且对细胞凋亡具有调控作用[11]。DMOG作为缺氧模拟剂可以抑制HIF-1α亚基降解，提高其活性，高度表达的HIF-1α可进入细胞核与HIF-1β亚基形成有活性的二聚体HIF-1，HIF-1再与下游靶基因作用发挥相应生物学功效。DMOG能抑制MSCs因缺血损伤引起的凋亡，其机制可能为对凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax表达的调控[12-13]。本课题通过Western blot检测，发现40μM DMOG可以显著提高缺血损伤MSCs中抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，抑制缺血损伤MSCs中促凋亡蛋白Bax的表达。通过MTT法检测各组MSCs增殖能力，以此研究DMOG对MSCs缺血损伤的保护作用，实验结果表明，40μM浓度组OD值高于缺血清组，但低于正常组，提示40μM DMOG给药浓度对MSCs在缺血损伤环境下有一定的保护作用。而20μM DMOG和80μM DMOG组OD值皆低于缺血清组，提示该两组DMOG给药浓度不能提高MSCs在缺血损伤环境下的存活率。同时，台盼蓝染色结果也表明40μM DMOG组的活细胞比例显著高于20μM和80μM组。

综上所述，本研究结果提示DMOG 20μM可显著促进MSCs成骨分化能力，DMOG 40μM可有效提高缺血损伤MSCs的增殖能力和存活率。研究结果中，DMOG促进MSCs成骨分化和提高缺血损伤MSCs的增殖能力、存活率的浓度不一致，可能与MSCs缺血清损伤前后对DMOG敏感程度不同有关，具体机制我们将在后续实验中展开更为深入的研究。在低浓度DMOG对各种细胞作用的研究中，Marchbank等[14]发现10~70μM浓度的DMOG能呈剂量依赖的促进人HT29细胞增殖，6.25~25μM浓度的DMOG能呈剂量依赖的促进人HT29细胞迁移能力，且本研究结果发现DMOG 20μM处理对MSCs成骨分化有显著促进作用，这也给予我们启示：在后续实验中开展更低浓度DMOG对MSCs成骨分化能力影响的实验研究十分必要，可为进一步完善和丰富本研究成果提供一定的理论基础。

References：

[1]石正松，李强，宁寅宽，等．Ad-BMP-2/BMSCs/DBM对兔股骨头坏死修复的实验研究[J]．安徽医科大学学报，2016，51（1）：59-63．SHI Zhengsong,LI Qiang,NING Yinkuan,et al.Experimental study on the repair of Ad-BMP-2/BMSCs/DBM for rabbits’femoral head necrosis[J].Acta Universitatis Medicinalis Anhui,2016,51(1):59-63.

[2]郑超，郑秋坚，林帧，等．缺血性股骨头坏死的治疗进展[J]．实用骨科杂志，2014，20（1）：43-47．ZHENG Chao,ZHENG Qiujian,LIN Zhen,et al.The advances in the treatment of ischemic necrosis of femoral head[J].Journal of Practical Orthopaedics,2014,20(1):43-47.

[3]何伟.如何把握股骨头坏死患者的保髋治疗时机[J]．中国骨与关节杂志，2016，5（2）：82-86．HE Wei.Timing of hip preservation for patients with osteonecrosis of the femoral head[J].Chinese Journal of Bone and Joint,2016,5(2):82-86.

[4]Johnson K,Jennings L,Schultz P.Mesenchymal stem cell differentiation:U.S.Patent 9,139,633[P].2015-9-22.

[5]GandhimathiC,VenugopalJR,Tham A Y,etal. Biomimetic hybrid nanofibrous substrates for mesenchymal stem cells differentiation into osteogenic cells[J].Materials Science and Engineering:C,2015,49（4）:776-785.

[6]李红霞，周亚峰，杨向军，等．GATA-4过表达增加大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞[J]．基础医学与临床，2013，33（1）：60-65．LI Hongxia,ZHOU Yafeng,YANG Xiangjun,et al.Overexpressing GATA-4 increases rat bone marrow mesenchymal stem cells transdifferentiating into cardiomyocytes[J]. Bascic&Clinical Medicine,2013,33(1):60-65.

[7]Jinghui Zheng,Yi Wan,Jianhuai Chi,et al.The active principle region of Buyang Huanwudecoction induced differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into neural-like cells[J].Neural Regeneration Research, 2012,7(4):261-267.

[8]Ciuffreda MC,Malpasso G,Musarò P,et al.Protocols for in vitro Differentiation ofHuman MesenchymalStem Cells into Osteogenic,Chondrogenic and Adipogenic Lineages[M].Mesenchymal Stem Cells:Methods and Protocols, 2016:149-158.

[9]张磊，赵学凌，李彪，等．二甲基乙二酰基甘氨酸促进骨髓间充质干细胞成骨分化 [J]．中国骨质疏松杂志，2012，18（11）：1048-1053．ZHANG Lei,ZHAO Xueling,LI Biao,et al.Dimethyloxalyl glycine promotes osteogenesis by bone marrow mesenchymal stem cells[J].Chinese Journal of Osteoporosis, 2012,18(11):1048-1053.

[10]粟钦．DMOG对兔骨髓间充质干细胞体外增殖与成骨分化影响的实验研究[D].昆明医科大学，2013．SHU Qin.The experimental study of DMSO solution on the effect of rabbit BMSCs Osteogenic differentiation and cell proliferation in vitro[D].Kunming Medical University, 2013.

[11]Ding H,Gao YS,Wang Y,et al.Dimethyloxaloylglycine increases the bone healing capacity of adipose-derived stem cellsbypromotingosteogenicdifferentiation and angiogenic potential[J].Stem Cells Dev,2014,23(9):990-1000.

[12]张磊，赵学凌，李彪，等．二甲基乙二酰基甘氨酸对小鼠骨髓间充质干细胞缺血清凋亡及Bcl-2/Bax蛋白表达的影响[J]．中国骨质疏松杂志，2013，19（1）：21-25．ZHANG Lei,ZHAO Xueling,LI Biao,et al.Effect of dimethyloxalglycine on the apoptosis induced by serum deprivation and expression of Bcl-2/Bax in mouse bone marrow mesenchymal stem cells[J].Chinese Journal of Osteoporosis,2013,19(1):21-25.

[13]Liu XB,Wang JA,Ji XY,et al.Preconditioning of bone marrow mesenchymal stem cells by prolyl hydroxylase inhibition enhances cell survival and angiogenesis in vitro and after transplantation into the ischemic heart of rats [J].Stem cell research&therapy,2014,5（5）：1-12.

[14]Marchbank T,Mahmood A,Harten S,et al.Dimethyloxalyglycine stimulates the early stages of gastrointestinal repair processes through VEGF-dependent mechanisms[J]. Lab Invest,2011,91(12):1684-1694.

The Effects of DMOG on MSCs Osteogenic Differentiation and Ischemic Injury

GE Tingting,YU Qin,ZHU Li,et al
College of Life Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

[Objective]Isolating and culturing rat bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)in vitro,we aimed to understand the effects of different concentrations of DMOG on their osteogenic differentiation and ischemic injury.[Methods]Whole bone marrow adherent method was used to obtain the MSCs, MSCs were induced to differentiate into osteoblast while giving 20μM,40μM,80μM concentrations of DMOG,and conducted the quantitative measurement of alkali quantitative phosphatase(ALP)at the time when cultivated 3d,7d and 14d,respectively,and performed Von Kossa staining when cultured 14d; Established MSCs ischemic injury model,while treated with different concentrations of DMOG,protein level of Bcl-2/Bax was detected by Western blot, then MTT method was used to detect the MSCs proliferation ability,and trypan blue staining was used to detect the MSCs viability.[Results]DMOG treatment may promote the ALP expression in osteogenic differentiation of MSCs,and DMOG 20μM treatment had the most significant role in promoting; ALP expression of each group in the osteogenic differentiation of MSCs increased in a time-dependent manner.In DMOG 20μM group,the black mineralizing matrix secretion was significantly more than other groups.40μM DMOG can significantly improve the expression of Bcl-2 protein,inhibit the expression of Bax protein in ischemic injury MSCs,and significantly promote proliferation and survival ability of ischemic injury MSCs,DMOG 20μM,80μM treatment had no significant promotion or inhibition effect.[Conclusion]DMOG 20μM could significantly promote osteogenic differentiation ability of MSCs; DMOG 40μM could effectively improve the proliferation ability and survival rate of ischemic injury MSCs.

mesenchymal stem cells;dimethyloxalglycine;osteogenic differentiation;ischemic injury;apoptosis

R331

：A

：1005-5509（2017）05-0400-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.05.014

2016-12-27）

浙江省新苗人才计划项目(2015R410048)；浙江省教育厅科研项目（Y20163679）

Fund projects:Xinmiao Talent Project of Zhejiang Province(2015R410048);Foundation of Zhejiang Education Committee (Y20163679)

周丽萍，E-mail：lipingzhou1219@126.com