高效液相色谱法快速测定青海牛羊肉和内脏组分中尿酸和嘌呤

王静莹+薄海波+吉生军+杨娟

摘 要：建立青海牛羊肉和内脏组分中尿酸和4 种嘌呤（鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤）的2 种分析方法，一种是采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法同时测定上述5 种组分，并折算出尿酸总含量；另一种是采用生物酶解法将嘌呤全部转化后，采用HPLC法快速测定其降解产物尿酸。2 种方法均采用Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18色谱柱分离，浓度为7×10-3 mol/L的KH2PO4-H3PO4（pH=3.83）溶液作为流动相，紫外检测波长为254 nm。结果表明：同时测定法中，被测物质在上述条件下分离良好，在较宽的浓度范围内线性良好，相关系数（r）均在0.998 4以上，平均回收率为92.2%～119.8%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.78%～10.43%；转化后尿酸快速测定法中，被测物质在1～70 mg/L质量浓度范围内与峰面积间的线性关系良好，r=0.999 4。将2 种分析方法得出的总尿酸含量进行比较，经配对t检验，结果无显著性差异（P=0.773>0.05）。2 种方法均可用于牛羊肉和内脏组分中嘌呤类物质的检测。

关键词：高效液相色谱法；尿酸；嘌呤；酶解转化

Abstract： Two analytical methods were developed to determine uric acid and four purines （guanine， hypoxanthine， xanthine and adenine） in meat and viscera of cattle and sheep from Qinghai province. One was based on the simultaneous determination of five individual components by high performance liquid chromatography （HPLC） for subsequent calculation of total uric acid， while the other was based on the enzymatic transformation of all four purines to uric acid for rapid determination of the degradation product by HPLC. In both methods， the chromatographic separation was performed using an Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18 column with 7 × 10-3 mol/L KH2PO4-H3PO4 （pH 3.83） as mobile phase， and the analytes were detected at 254 nm. Results shows that the first method achieved good separation and good linearity in a wide concentration range with all correlation coefficients being higher than 0.998 4， and the recoveries were between 92.2% and 119.8% with relative standard deviations （RSD） between 0.78% and 10.43%. Similarly， the second method had a good linearity in the range of 1–70 mg/L with correlation coefficients of 0.999 4. The values of total uric acid obtained by the two methods did not significantly differ from each other as indicated by the matched pairs t-test （P = 0.773 > 0.05）. The two methods could be used for the detection of purine compounds in bovine and sheep meat and viscera.

Key words： high performance liquid chromatography （HPLC）； uric acid； purine； enzymatic conversion

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201705008

中图分类号：O657.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）05-0040-06

嘌呤（purine）是组成核酸的重要碱基。常见的嘌呤主要有腺嘌呤（adenine，A）、鸟嘌呤（guanine，G）、黃嘌呤（xanthine，X）和次黄嘌呤（hypoxanthine，H）[1]。

饮食是人体内嘌呤的重要来源，嘌呤摄入量过多时易引起痛风，饮食控制对避免痛风发生和复发有特别重要的作用。嘌呤及其最终代谢物尿酸（uric acid）的检测对人体的一些疾病和代谢紊乱的诊断极为重要[2]。尿酸又名2，6，8-三羟基嘌呤，是血浆中非蛋白氮的重要组分之一[3]。尿酸与VC有相似的抗氧化作用，能清除体内的自由基[4]。有研究[5]表明，高嘌呤含量的食物摄入过多会引起血液中尿酸水平升高，从而引发高尿酸血症（hyperuricemia，HUA），5%～12%的HUA患者因长期不愈导致痛风。随着社会经济的不断发展及人民膳食结构的变化，HUA和痛风的患病率逐年增加[6]，并有年轻化趋势[7]。

嘌呤的检测方法主要有液相色谱法、纸层析法、电泳法、薄层色谱法、气相色谱法和离子色谱法等[8]，高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法具有高效、方便、快捷、选择性高等优点，在嘌呤研究领域应用较广泛。样品中嘌呤的提取方法有酸提取法[9-13]、有机溶剂萃取法[14-15]和超声辅助萃取法[16-18]。

其中酸提取法多采用高氯酸[19-22]、三氟乙酸和甲酸混合液[23-25]水解样品。所有嘌呤类物质的代谢产物都是尿酸，食品中嘌呤检测的最终目的是评价尿酸对人体健康的影响。尿酸的检测分析方法有紫外分光光度法[26]、液相色谱法[27-28]、磷钨酸还原法[29]和同位素稀释法[30]等。

本研究拟建立肉类中尿酸和4 种嘌呤的2 种分析方法，一种是采用HPLC法同时测定上述5 种组分；另一种是将G和A通过重氮化反应转化为H和X，再在黄嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸，采用HPLC法快速测定总尿酸含量。并采用上述2 种方法测定青藏高原牛羊肉和内脏组分中尿酸和4 种嘌呤的含量，将2 种方法测得的总尿酸含量进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜黄牛肉、牦牛肉、牛肉、牛头肉、牛杂碎（含有牛肚、牛筋、牛排、牛腩等內脏）、手抓羊肉、羊杂碎（含有羊肚、羊心、羊肺、羊肠、羊肝等内脏） 西宁市各大市场。-20 ℃冷冻保存。

尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤标准品（纯度>98.0%） 美国Agilent公司；黄嘌呤氧化酶（生化试剂） 上海源叶生物科技有限公司；实验用水均为超纯水。

高氯酸 天津东方化工厂；磷酸 天津市滨海科迪化学试剂有限公司；盐酸 白银良友化学试剂有限公司；氢氧化钾、氢氧化钠 天津致远化学试剂有限公司；磷酸二氢钾 北京红星化工厂；磷酸二氢钠 天津凯通化学试剂有限公司；磷酸氢二钠（分析纯） 西安化学试剂厂；亚硝酸钠 天津北辰方正试剂厂；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

戴安U1tiMate 3000高效液相色谱仪（配有紫外检测器） 美国戴安公司；752型紫外-可见分光光度计 上海现科分光仪器有限公司；L600湘仪离心机 湘仪离心机仪器有限公司；WB-2000水浴锅、R1001-VN旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司； FW-100高速万能粉碎机 绍兴市科弘仪器有限公司；雷磁PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；TG332A微量分析天平 湘仪天平仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 HPLC色谱条件

色谱柱：Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；柱温30 ℃；流动相：7×10-3 mol/L KH2PO4-H3PO4（pH=3.83）；流速1.0 mL/min；检测器：紫外检测器，检测波长254 nm；进样量10 ?L。

1.3.2 溶液配制

称取尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤标准品各0.050 0 g，加入20 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，分别用体积分数为10%甲醇定容至100 mL，摇匀，得质量浓度为500 mg/L的标准单一储备溶液。-20 ℃保存。

1.3.3 样品制备

将牛羊肉、牛羊杂碎用刀切碎，用高速万能粉碎机绞碎并匀浆，-20 ℃冷冻保存备用。

1.3.4 样品前处理

样品水解：称取0.200 0 g样品于10 mL具塞刻度离心管中，加入3 mL体积分数为10% HClO4，摇匀，在沸水浴中水解60 min，冷却。用NaOH溶液调节pH值至3.8左右，再用超纯水定容至10 mL，3 000 r/min条件下离心30 min，上清液用滤纸过滤。滤液经0.45 ?m微孔滤膜过滤，HPLC法分别测定尿酸和4 种嘌呤的含量。

重氮化反应：取上述水解液的上清液2 mL于10 mL具塞刻度离心管，用稀盐酸调节pH值至3.8左右，加入1.10 mL 1.2 mol/L的HCl溶液、0.25 mL 150.0 g/L的NaNO2溶液，振荡，55 ℃恒温水浴30 min。

酶解转化：将重氮化反应后的溶液冷却至室温，用NaOH溶液调节pH值至中性，加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.5）2.0 mL，黄嘌呤氧化酶（300 U/L）4.0 mL，用超纯水定容至10 mL，振荡，30 ℃恒温水浴30 min，冷却至室温。0.45 ?m微孔滤膜过滤，HPLC法测定总尿酸的含量。

1.4 数据处理

采用SPSS软件对数据进行配对样本t检验。

2 结果与分析

2.1 实验条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

实验对比了Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18、Agilent 5 HC-C18和资生堂CAPCELL PAK-C18 3 种色谱柱（规格均为4.6 mm×250 mm，5 ?m）对样品的分离效果，用尿酸和4 种嘌呤的混合标准溶液作为样品，综合考察色谱柱对5 种组分的分离情况。由图1可知，3 种色谱柱对各个组分的分离度均可达到分析测定的要求，Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18柱分析5 种组分的保留时间较短，故选择其作为本研究用色谱柱。

2.1.2 流动相的优化

2.1.2.1 缓冲液pH值的选择

采用KH2PO4-H3PO4缓冲液做流动相，其pH值对目标组分的分离效果和保留时间影响较大。考察pH值分别为3.65、3.83、3.93、4.15的KH2PO4-H3PO4溶液（浓度均为7.0×10-3 mol/L）对尿酸和4 种嘌呤峰形和分离效果的影响，结果如图2所示。

嘌呤碱基呈微弱的碱性，在色谱柱上的保留行为对流动相酸度非常敏感。由图2可知，在缓冲液pH值为3.65和4.15时，G和H的分离度较差，且A的保留时间较长；pH值为3.93时，G和H的分离度较pH 3.65和pH 4.15较好，但仍达不到分析测定要求；pH值为3.83时，5 种组分的分离度均能达到分析测定要求，色谱峰形尖锐，对A的保留时间较pH 3.65和pH 4.15时短，可减少分析检测时间，故确定缓冲液的pH值为3.83。

2.1.2.2 缓冲盐浓度的选择

考察浓度分别为2.0×10-4、5.0×10-3、7.0×10-3、1.0×10-2、2.0×10-2 mol/L的KH2PO4-H3PO4溶液（pH值均为3.83）对尿酸和4 种嘌呤峰形和分离效果的影响，结果如图3所示。

由图3可知，KH2PO4-H3PO4溶液浓度为7.0×10-3 mol/L时，分离效果最好，峰形尖锐、对称。出峰顺序依次为尿酸、G、H、X、A。故选择缓冲液浓度为7.0×10-3 mol/L。

2.1.3 酶解条件的优化

2.1.3.1 重氮化反应中HCl和NaNO2用量的选择

冯晓晶等[26]探讨了重氮化反应和酶解反应的条件，4 种嘌呤可全部转化为尿酸。本研究在此基礎上做进一步优化。G和A与亚硝酸盐作用，并在酸性溶液中分别转化为H和X，然后在黄嘌呤氧化酶的作用下转化为嘌呤终产物——尿酸。

G、H、X、A的质量浓度分别为4 mg/L，按1.3.4节进行重氮化反应和酶解反应，分别改变1.2 mol/L HCl溶液和150.0 g/L NaNO2溶液的加入量，根据生成尿酸的峰面积来评估HCl和NaNO2溶液的加入量对反应的影响。

由表1可知，1.2 mol/L HCl溶液和150.0 g/L NaNO2溶液的适应加入量分别为1.10、0.25 mL。

2.1.3.2 黄嘌呤氧化酶用量的选择

4 种嘌呤的质量浓度均为4 mg/L时，改变300 U/L的黄嘌呤氧化酶溶液的加入量，确保能将4 种嘌呤高效率地转化为尿酸。

由表2可知，黄嘌呤氧化酶溶液加入量为4.0～5.0 mL时，尿酸峰面积相差不大，出于对试剂成本和转化率的综合考虑，选择黄嘌呤氧化酶溶液的加入量为4.0 mL。

2.2 标准曲线及线性范围

2.2.1 5 种组分的线性关系

用超纯水对尿酸和4 种嘌呤的标准单一储备液进行逐级稀释，配制成5 种分析组分的系列标准混合溶液。在1.3.1节所述的色谱条件下，分别取10 ?L进样。采用外标法对系列标准溶液的峰面积（y）和相应的质量浓度（x）进行线性回归计算。

由表3可知，尿酸和4 种嘌呤的质量浓度和峰面积在0.05～50.00 mg/L线性范围内的线性关系良好，相关系数（r）在0.998 4～0.999 6之间。

2.2.2 尿酸单组分的线性关系

用超纯水对尿酸标准单一储备液进行逐级稀释，配制成单组分系列标准溶液。采用外标法对尿酸标准溶液的峰面积（y）和相应的质量浓度（x）进行线性回归计算。线性方程为y=0.18x+0.03，r为0.999 4，线性范围为1～70 mg/L。

2.3 检出限和定量限

分别将5 种组分的混合标准溶液和尿酸标准溶液配成低质量浓度的溶液进样，以3 倍信噪比为检出限（limit of detection，LOD），6 倍信噪比为定量限（limit of quantification，LOQ）。分别测定法中5 种组分的检出限和定量限见表3；转化后尿酸快速测定法中尿酸的检出限为0.096 mg/L，定量限为0.192 mg/L。

2.4 回收率和精密度

采用牛肚样品做尿酸和4 种嘌呤的添加回收实验。取牛肚样品18 份，每份0.2 g（精确到0.000 1 g），分别添加质量浓度为16 mg/L的混合标准溶液0.4、1.0、4.0 mL，3 个添加水平分别为32、80、340 mg/kg，每个水平6 次平行，按1.3.4节进行样品水解处理，在最佳色谱条件下测定。

由表4可知，尿酸在3 个添加水平时的平均加标回收率在92.5%～105.5%之间，方法的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在0.78%～10.43%之间；G的平均回收率为94.0%～119.8%，RSD为1.29%～10.12%；H的平均回收率为99.5%～114.9%，RSD为1.05%～9.07%；X的平均回收率为92.5%～93.1%，RSD为1.54%～8.08%；A的平均回收率为92.2%～94.0%，RSD为2.91%～8.14%。

将5 种组分的混合标准溶液连续进样6 次，根据测定结果分别计算尿酸和4 种嘌呤的RSD。由表5可知，5 种组分的RSD均在0.25%～0.81%之间，表明仪器的精密度良好。

2.5 2 种方法的测定结果及对比

在1.3.1节的条件下，采用同时测定法和转化后尿酸快速测定法分别对1.3.3节中的样品进行分析测定。第1种方法测定得到的5 种组分的含量根据相对分子质量全部折算为尿酸的总含量，并将计算结果与第2种方法测得的总尿酸含量进行比较。牛肚样品及其加标样品的色谱图见图4，样品测定结果及比较见表6。

采用同时测定法测得的青藏高原牛羊杂碎中总尿酸含量为159～3 750 mg/kg，转化后尿酸快速测定法测得的总尿酸含量为165～3 768 mg/kg。牛杂碎（牛肚、牛筋、牛排、牛腩等）中的尿酸总含量普遍低于牛肉、黄牛肉和牦牛肉；羊肝、羊心和羊肺中的尿酸总含量高于手抓羊肉，而羊肚、羊排和羊肠中的尿酸总含量低于手抓羊肉，其中羊肝和羊肺中总嘌呤含量较高，牛肚和羊肚中总嘌呤含量较低。

采用SPSS软件对2 种方法的测定结果进行配对t检验，结果表明，配对样本P=0.000<0.005，表明2 种方法的测定结果具有相关性；t=-0.295，自由度=12，双侧检验P=0.773>0.05，2 种方法测定总尿酸含量的结果间无显著性差异。

3 结 论

本研究建立了肉类中尿酸和4 種嘌呤（G、H、X、A）的2 种分析方法，即采用HPLC法同时测定5 种组分和将全部嘌呤转化后再测定尿酸含量的快速测定法。同时测定法测得青藏高原牛、羊杂碎中的总尿酸含量为159～3 750 mg/kg；转化后尿酸快速测定法测得的青藏高原牛、羊杂碎中的总尿酸含量为165～3 768 mg/kg。将2 种分析方法得出的总尿酸含量进行比较，经配对t检验，双侧检验P=0.773>0.05，结果无显著性差异。2 种方法均可用于肉类中嘌呤类物质的分析测定。

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