正交法优选亮菌多糖脱色工艺研究

黄纯 王小平 程海涛 姜晟

摘要[目的]建立亮菌多糖脱色的最佳方法。[方法]以色素脱除率作为主要考察指标，通过单因素考察和正交法优化亮菌多糖脱色工艺。[结果]D152树脂、45 ℃、pH 5.0为最佳脱色条件。[结论]D152作用后色素脱除率高，糖保留率高，有益于下一步分离纯化。

关键词脱色素；亮菌多糖；工艺优化；正交法

中图分类号S567.3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）21-0133-02

Study on Decoloration Technique of Armillariella Polysaccharide by Orthogonal Experiments

HUANG Chun，WANG Xiaoping，CHENG Haitao et al

（China Pharmaceutical University，Nanjing，Jiangsu 211196）

Abstract[Objective] The research aimed to establish the optimum method of decoloration about Armillariella polysaccharide.[Method]Taking the decoloring ratio as main index， the optimum decoloring technique were established through single factorial test and orthogonal experiments.[Result]The best method of decoloration were obtained as follows： D152 resins working in pH 5.0 and 45 ℃. [Conclusion]The decoloring ratio of D152 and the reteion rate of polysaccharide are high， which is beneficial to the next step.

Key wordsDecoloration；Armillariella polysaccharide；Technology optimization；Orthogonal method

亮菌学名白蘑科假密环菌[Armillariella tabescens（Scop.EX.Fr）Sing]，是我国在20世纪60年代首次发现并拥有自主知识产权的一种真菌[1]。笔者前期从亮菌发酵菌粉中经热水提取、Sevag法去蛋白、乙醇沉淀等步骤得到亮菌多糖（Armillariella polysaccharide，ALP）粗品[2]，再经DEAE-纤维素色谱柱纯化后得2种多糖ALP1和ALP2，初步的药效试验已表明ALP2具有较好的抗肿瘤活性[3]。但在研究中也发现，亮菌多糖粗品中的色素在柱层析中不易脱除，是阻碍其纯品分离纯化、结构确定、作用机理、构效关系研究的瓶颈之一。因此，对亮菌多糖粗品进行脱色，一方面可以改善多糖的外观、提高亮菌多糖的纯度，另一方面也可为后续的各项研究打下基础。基于离子交换树脂和吸附树脂已有用于糖浆脱色的报道[4-5]，该试验尝试将其应用于亮菌多糖粗品脱色，通过对不同类型树脂的脱色效果和脱色条件的考察，找出能够有效脱除粗品中色素的工艺，为亮菌多糖的生产和研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

亮菌多糖粗品（自制）；大孔阳离子树脂D151、D152，大孔阴离子交换树脂D280、D201GF，大孔吸附树脂D4006、D3520、AB-8，天津波鸿树脂科技有限公司；硫酸、苯酚、葡萄糖 、乙醇、鹽酸、氢氧化钠，中国医药集团上海化学试剂公司；其余试剂皆为国产分析纯。722分光光度计，上海圣科仪器设备有限公司。

1.2方法

1.2.1树脂预处理。

去离子水反复洗涤树脂至无泡沫。阳离子交换树脂用5%盐酸、5%NaOH、5%盐酸，阴离子交换树脂用5%NaOH、5%盐酸、5%NaOH，各依次浸泡4 h，每次浸泡后以去离子水清洗至中性。吸附树脂以5%盐酸、5%NaOH依次浸泡4 h，每次浸泡后皆以去离子水清洗至中性，再用95%乙醇浸泡12 h，用去离子水洗至无醇味。

1.2.2树脂的筛选。

分别向圓底烧瓶中加入一定量预处理的D151、D152、 D280、D201GF、 D4006、D3520、AB-8树脂和浓度为1 mg/mL的ALP粗品溶液，调pH至中性，55 ℃水浴恒温振荡2 h，过滤，测定滤液的脱色率、糖保留率。

1.2.3测定方法及计算。

1.2.3.1脱色率的测定。调节pH至（7.0±0.1），5 000 r/min离心20 min后过滤，在420 nm处测定光密度值。

脱色率=（OD脱色前-OD脱色后）/OD脱色前×100%。

1.2.3.2糖含量测定及多糖保留率的计算。采用硫酸-苯酚法[6]测定糖含量。

多糖保留率=M前/M后×100%，

式中，M前、M后分别为脱色前后多糖的质量浓度。

1.2.4温度对树脂脱色效果的影响。

分别向圆底烧瓶中加入预处理的D151、D152、D4006和pH为5.5的ALP粗品溶液，在35、45、55、65、75 ℃水浴恒温振荡2 h，过滤，测定滤液的脱色率、糖保留率。

1.2.5pH对树脂脱色效果的影响。

分别向圆底烧瓶中加入预处理的D151、D152、D4006和pH分别为3.0、4.5、6.0、7.5、9.0的ALP粗品溶液，55 ℃水浴恒温振荡2 h，过滤，测定滤液的脱色率、糖保留率。

1.2.6正交设计优选脱色的工艺条件。

在单因素试验基础上，设计L9 （34）正交试验，通过正交试验确定最佳脱色条件。

2结果与分析

2.1树脂的初筛选

从表1可以看出，D151、D152、D280、D201GF、D4006的脱色率均达到50%以上；D151、D152、D4006糖保留率较高，其余树脂在脱色的同时多糖的损失很大。据此选出D151、D152、D4006这3种树脂做进一步研究。

2.2不同温度对脱色效果的影响

从表2可以看出，D151和D152脱色率在35～55 ℃随温度升高而增加，温度高于55 ℃后脱色率下降；D4006的脱色率在35～65 ℃随温度升高而增加，温度高于65 ℃脱色率下降。综合考虑，正交试验温度定为45、55、65 ℃。

2.3pH对树脂脱色效果的影响

从表3可以看出，D151在pH 3.0～4.5脱色率随pH的增加而增加，pH大于4.5后脱色率下降；D152在pH 3.0～6.0脱色率随pH的增加而增加，pH大于7.5后脱色率下降；D4006随着 pH的增加脱色率下降。综合考虑，将正交试验的pH定为3.5、5.0、6.5。

2.4正交试验

通过单因素试验，得出正交试验因素水平表（表4）。正交试验结果见表5。极差分析表明，各因素对树脂脱色率的影响程度从大到小依次为A、C、B，即树脂种类对脱色率的影响最大，pH次之，温度的影响最小；方差分析表明，树脂种类、pH对脱色率的影响均达到显著水平，温度对脱色率的影响不显著。

2.5验证试验

以脱色率作为考察指标，理论上最佳组合是A2B2C2，而正交试验的最佳组合是A2B1C2，故需进行验证试验。验证试验结果表明，A2B2C2和A2B1C2的脱色率分别为88.1、88.6%，2种组合的脱色率和糖保留率基本接近。考虑到A2B1C2组合能耗更低，故选择A2B1C2。并且要求树脂在脱色素的同时应尽可能多地保留糖，A2B1C2具有较高的糖保留率，符合要求。

3小結与讨论

亮菌多糖粗品是亮菌发酵菌粉经水提醇沉得到的棕色粉末，其中色素的种类、性质、结构目前鲜见报道。从树脂初筛的试验结果来看，属于阳离子交换树脂的D151、D152和阴离子交换树脂D280均有较好的脱色效果，推测亮菌多糖粗品中的色素既有阳离子型也有阴离子型，成分比较复杂。离子交换树脂在发挥作用时，除了离子交换过程外，还存在吸附作用，而D280树脂作用后，溶液中的多糖几乎检测不到，此现象有深入研究的必要。从正交试验结果来看，樹脂种类对脱色率的影响最大，pH次之，二者对脱色率的影响都达到显著水平，而温度对脱色率的影响则较小。究其原因，可能与色素分子的分子结构、带电情况、基团极性、是否容易与吸附树脂的表面基团形成氢键等因素有关，尚需要继续研究。多糖的进一步分离纯化往往采用离子交换色谱法，色素的残留会对离子交换树脂产生毒害。经过D152作用后色素的脱除率达到85%，而此条件下多糖的保留率近90%，所以正交试验确定的工艺条件对进一步分离得到高纯度、高产率的亮菌多糖非常有益。

参考文献

[1] 江苏省“亮菌”科研协作组化学小组.假密环菌的研究Ⅱ.假蜜环菌素的分离及化学结构的测定[J].微生物学报，1974，14（1）：9-16.

[2] 黄纯，宋慧智，马驰，等.亮菌多糖提取工艺研究[J].安徽农业科学，2006，34（19）：5027-5028.

[3] 黄纯，周凤娟.亮菌多糖的纯化工艺及抗肿瘤活性研究[J].江西中医学院学报，2007，19（6）：65-66.

[4] ROTHCHILD R D.Decolorizing by adsorption with a non functional resin[J].International sugar journal，1994，96（1144）：145-146，149-152.

[5] 黄祥斌，于淑娟，高大维.几种离子交换树脂用于糖浆脱色的比较研究[J].食品科学，2001，22（4）：11-13.

[6] 张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1999.

安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（21）：135-137，145