西瓜花粉自发荧光特征与荧光成像效果分析

乔飞 江雪飞 张彦

摘 要 以西瓜的花粉为材料，研究西瓜花粉自发荧光的光谱特征、荧光强度，并结合结构照明显微技术优化花粉自发荧光成像方法。结果表明：西瓜花粉的自发荧光在蓝色波段最强；新鲜花粉在储藏过程中荧光强度变化不大；西瓜花粉的自发荧光主要位于花粉外壁网纹上；分别用苯胺蓝、Calcofluor white、碘化丙啶、吖啶橙对西瓜花粉染色后，花粉的其他部位在不同荧光通道下也可以呈现荧光。因此，本研究建立的方法不仅可用于分析西瓜花粉的大小、形态、外壁纹理、萌发孔、萌发沟等形态特征，还可以反映花粉表面荧光物质分布的特征。

关键词 花粉；西瓜；荧光；染色；结构照明显微镜

中图分类号 Q944.57 文献标识码 A

Abstract With watermelon pollen as the material， the spectrum and intensity of the autofluorescence were investigated， and the photography of the autofluorescence of pollens were optimized combined with Apotome microscope. The results showed that the maximum intensity of autofluorescence was in blue spectrum； The intensity of autofluorescence in fresh pollens fluctuated only slightly during storage； And the autofluorescence was located mainly on the reticula. After staining the pollens with aniline blue， calcofluor white， propidiumiodide， acridine orange respectively， the other parts could also be fluorescent in specific channels. Therefore， the optimized method could be not only suitable for observing the size， shape， reticulum， aperture and germ furrow， but also indicate the distribution of chemical composition.

Key words Pollen； watermelon； fluorescence； staining； Apotome microscope

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.024

花粉是種子植物特有的结构，具有较强的遗传保守性，不同种类植物的花粉粒在形状、大小、外壁和纹理等方面都有着明显的差别。西瓜花粉为近球形，具3孔沟，沟连接两极，萌发孔为圆形，外壁具有网纹结构，网眼大小不等但分布较为均匀[1]。植物花粉的形态和大小可由光学显微镜显微观察，而细微的纹理结构多由扫描电子显微镜观测[2-3]。定量测量花粉的形态指标，已广泛应用于植物分类、系统进化、育性鉴定等领域[4-6]。

花粉中含有多种荧光物质，包括孢粉素、木质素、芳香族氨基酸、NADH、NADPH、核黄素、多酚类物质等[7]。近年来已有利用花粉的自发荧光结合激光共聚焦扫描显微技术，重构花粉的三维图像的研究[8-10]。此外，根据花粉的自发荧光光谱特征，还可以区分植物的种类[11]。然而，哪些波段的自发荧光更适合用来重构花粉的图像，这些荧光位点是否和特定的结构相关，尚未见报道。本研究以西瓜的花粉为材料，结合荧光结构光学3D成像技术[12]，研究了不同荧光通道下西瓜花粉荧光成像效果。此外，本研究还利用几种荧光染料对西瓜花粉进行染色，对利用荧光染料染色重构花粉的三维图像的效果进行了分析比较。

1 材料与方法

1.1 材料

西瓜花粉采自海南省儋州市中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所。实验分别观察了新鲜花粉和4 ℃干燥保存了7、14、21和28 d的花粉。

1.2 方法

1.2.1 花粉自发荧光观察 将新鲜花粉或者保存的花粉放在载玻片上，加一滴水，盖上盖玻片，用荧光显微镜（Zeiss， AxioImager Z2+ApoTome）观察。将荧光光源（X-Cite 120Q）强度开到最大，固定曝光时间（5 ms），分别在DAPI、GFP、RFP、CFP、YFP和Rhodamine共5个荧光通道下拍照。不同荧光通道的参数设置具体见表1。花粉荧光强度用显微镜配套软件（Zen 2）测量。每个样品统计30粒以上花粉，求平均值。

用显微镜的ApoTome模块逐层采集花粉z轴图像，用最大投影法（MIP）重构花粉的3D图像。

1.2.2 花粉染色与成像观察 DAB染色液配制参照Johnson-Brousseau和McCormick的方法[13]。Calcofluor white染色液，购自Sigma-Aldrich公司，使用时1 ∶ 1（V ∶ V）加入10%的KOH。碘化丙啶（Propidium Iodide），购自Sigma-Aldrich公司，加水配成浓度为20 μg/mL的PI染色液。吖啶橙（Acridine Orange），购自Sigma-Aldrich公司，加水配成浓度为0.5 μg/mL的AO染色液。

取新鲜花粉，加1滴染色液，染色10 min，盖上载玻片，置于载物台上，显微观察方法同上。

1.3 数据分析

用Excel作图，用SPSS软件进行方差分析，选择多重比较LSD法，“*”表示差异达到显著（p<0.05），“**”表示差异达到极显著（p<0.01）。

2 结果与分析

2.1 新鲜花粉的自发荧光强度分析

在DAPI、CFP、YFP、GFP和Rhodamine共5个通道下分别测定新鲜花粉的自发荧光强度，发现西瓜花粉有较强的紫色荧光，其次为青色荧光和绿色荧光，黄色荧光和红色荧光最弱（图1）。经方差分析，紫色荧光、青色荧光和绿色荧光的强度极显著高于黄色荧光和红色荧光。

2.2 干燥保存花粉自发荧光强度变化分析

新鲜花粉经4 ℃干燥贮藏，每7 d观察测定其储藏花粉荧光强度的变化（见图2）。结果发现，西瓜花粉自发荧光并未随储藏时间的延长而明显下降，其中黄色荧光通道的荧光强度值呈现下降趋势，其他通道的荧光强度值均呈现出先上升再下降的趋势。红色荧光（Rhodamine）通道的荧光强度值在储藏21 d时有较为明显的上升，但到28 d时又迅速降低。不同通道荧光强度值在贮藏期间变化明显，和新鲜花粉比较，差异多达到极显著水平（显著性用“*”标记，见图2）。

2.3 不同染料对花粉荧光的影响

用吖啶橙、苯胺蓝、Calcofluor white和碘化丙啶分别对新鲜花粉染色，染色后在不同荧光通道下测定花粉的荧光强度，经测定值和花粉的自发荧光强度进行比较作图（见图3）。结果表明，4种染料对西瓜花粉紫色荧光（DAPI）、青色荧光（CFP）和绿色荧光（GFP）的强度影响较小，对黄色荧光（YFP）和红色荧光（Rhodamine）的影响则较大，其中，经吖啶橙染色后，西瓜花粉的黄色荧光强度上升了20多倍。经方差分析，染色后的各通道的熒光强度和对照相比，差异均达到了极显著水平。

2.4 花粉自发荧光3维重构成像效果分析

如图4所示，新鲜花粉在不同荧光通道下均可成像。但是用普通的表面荧光观察，大量的非焦平面杂散光进入，导致成像较为模糊。用Apotome结构照明结合3D软件模块的方法成像，可有效去除非焦平面杂散光，成像清晰，可区分花粉的萌发孔、孔沟和外壁纹理结构。

2.5 不同荧光染料染色后3维重构成像效果分析

4种染料染色后，不仅花粉的整体荧光强度发生了相应变化（图3），而且部分位置、结构的荧光强度也有增强（图5）。苯胺蓝染色后，除萌发沟荧光增强外，其他部位荧光未呈现明显变化。Calcofluor white染色后，DAPI通道下，萌发孔和萌发沟均呈现出了较强的荧光。碘化丙啶染色后，DAPI、CFP、GFP和YFP通道下萌发孔呈现较强荧光，并且在DAPI通道下，萌发沟亮度也明显增强；此外，在CFP、GFP和YFP通道下，花粉外壁网孔内壁也被染色，从而网脊和网孔呈现连续荧光，影响对网孔的观察。吖啶橙染色后，DAPI通道和RFP通道基本没有变化，但CFP、YFP和GFP通道下，萌发孔周围呈现非特异性荧光。

3 讨论

花粉具有自发荧光，不同种类植物花粉的自发荧光光谱并不相同。Urbanczyk等[14]的研究表明，39种不同泥炭植物的发射光谱最大峰值多位于465～565 nm之间。本研究中西瓜花粉在DAPI通道（420～470 nm）荧光强度最大，说明植物花粉的荧光光谱具有特定的特征。Mitsumoto等[11]发现花粉蓝色荧光和红色荧光的比值甚至可以在种的水平区分物种。此外本研究发现，西瓜花粉在贮藏期间可保持较强荧光，在4 ℃冷藏4周后，除黄色荧光外其他通道荧光强度均无明显降低（图2）。

结合激光共聚焦扫描显微镜，花粉的自发荧光也可以用来成像[5，15]，但是，自发荧光在花粉表面的分布并不均匀，例如，本研究中西瓜花粉的外壁纹理可以清楚成像，在不同荧光通道均可成像，不仅可用于分析花粉粒的大小、形状，还可以分析网纹的大小、形态。而萌发孔和萌发沟虽然没有荧光，但和外壁网纹区分明显，形态大小均可观察。由于花粉中有多种荧光物质[7]，花粉表面荧光的强弱、分布及光谱和这些荧光物质的分布可能就存在相关性。因此，本研究在对样品未做任何处理的情况下，分析了花粉的荧光成像特点，结果暗示西瓜花粉外壁网纹中应富含荧光物质。本研究表明，利用结构照明和3D成像显微镜，也可以对花粉进行荧光成像，并且适用于表面结构纹理荧光种类差异较大的花粉成像。和经典的扫描电子显微镜成像[1-3]相比，利用花粉自发荧光成像具有简单、快捷的优势，但是光学显微镜的分辨率远远低于电子显微镜。因此，对于那些粒径较小的花粉以及花粉表面精细纹理结构的观察，是本方法以及前人报道的其他光学显微观察方法[8-10]难以达到的。

为了进一步对没有自发荧光的部位进行成像，本研究筛选了常用于花粉和细胞壁染色观察的染料，包括：苯胺蓝[13]、Calcoflour white[16]、碘化丙啶[17]和吖啶橙[18]。这4种染料除了吖啶橙是非特异染料外，苯胺蓝、Calcofluor white和碘化丙啶分别可特异性的和胼胝质[13]、葡聚糖[19]和半乳醛聚糖[20]这些多糖类物质特异性结合。因此，利用这些染料染色后观察花粉的荧光成像特征，也可以进一步分析花粉表面的化学物质组成分布，本研究的结果（图5）表明了萌发孔、萌发沟和外壁网纹在化学组成上的差异。但是，染色的效率不仅和这些化合物的含量相关，还受到花粉表面发育状况、固定方法的影响[21]。因此，对于不同种类的花粉的染色观察，需要分别探索建立适合的方法。

参考文献

[1] 刘文革， 王 鸣， 阎志红. 不同倍性西瓜花粉形态观察[J]. 园艺学报， 2003， 30（3）： 328-330.

[2] 王小蓉， 汤浩茹， 黄 力，等. 树莓部分野生种及栽培品种花粉亚显微形态的比较[J]. 园艺学报， 2007， 34（6）： 1 395- 1 404.

[3] 孙崇波， 向 林， 施季森， 等. 兰科5属常见栽培品种花粉块形态的扫描电镜观察[J]. 园艺学报， 2010， 37（12）： 1 969- 1 974.

[4] Erdtman G. Handbook of palynology， an introduction to the study of pollen grains and spores[M]. Munksgaard， Copenhagen， 1969.

[5] 高亚卉， 戴攀峰， 姬志峰， 等. 太行菊属植物花粉形态研究[J].西北植物学报， 2011， 31（2）： 2 464-2 472.

[6] 尹燕雷， 苑兆和， 冯立娟， 等. 山东20个石榴品种花粉亚微形态学比较研究[J]. 园艺学报， 2011， 28（5）： 955-962.

[7] OConnora D J， Iacopinob D， Healya D A， et al. The intrinsic fluorescence spectra of selected pollen and fungal spores[J]. Atmospheric Environment， 2011， 45（35）： 6 451-6 458.

[8] 刘振国，华子义. 激光扫描共聚焦显微镜在花粉研究中的应用[J]. 激光生物学报， 2013， 22（5）： 385-396.

[9] 丁 亮， 沈明山， 邵韩娟， 等. 激光扫描共聚焦显微镜对一串红花粉粒的三维重建[J]. 福建分析测试， 2000， 8（1）： 1 199- 1 202.

[10] 周丽华，黄光文. 激光扫描共聚焦显微镜在植物学中的应用[J]. 激光生物学报， 2005， 14（1）： 76-79.

[11] Mitsumoto K， Yabusaki K， Aoyagi H. Classification of pollen species using autofluorescence image analysis[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2009， 107（1）： 90-94.

[12] Weigel A， Schild D， Zeug A. Resolution in the ApoTome and the confocal laser scanning microscope： comparison[J]. Journal of Biomedical Optics， 2009， 14（1）： 221-228.

[13] Johnson-Brousseau S A， McCormick S. A compendium of methods useful for characterizing Arabidopsis pollen mutants and gametophytically expressed genes[J]. Plant J， 2004， 39： 761-775.

[14] Urbanczyk J， Casado M A F， Díaz T E， et al. Spectral fluorescence variation of pollen and spores from recentpeat-forming plants[J]. International Journal of Coal Geology， 2014， 131： 263-273.

[15] 何川生， 盧秀萍， 许介眉. 不同类型烟草花粉自发荧光强度比较研究[J]. 热带作物学报， 2000， 20（1）： 87-89.

[16] Herth W， Schnepf E. The fluorochrome， Calcofluor white， binds oriented to structural polysaccharide fibrils[J]. Protoplasma， 1980， 105： 129-133.

[17] Tian G W， Chen M H， Zaltsman A， et al. Pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth[J]. Developmental Biology， 2006， 294： 83-91.

[18] Liu D， Chen Z， Xu H， et al. In IFIP international federation for information processing，volume 293， computer and computing technologies in agriculture II， volume 1[M]. Boston： Springer， 2009： 329-334.

[19] Mollet J C， Leroux C， Dardelle F， et al. Cell wall composition， biosynthesis and remodeling during pollen tube growth[J]. Plants， 2013， 2： 107-147.

[20] Rounds C M， Lubeck E， Hepler P K， et al. Propidium iodide competes with Ca2+ to label pectin in pollen tubes and Arabidopsis root hairs[J]. Plant Physiology， 2011， 157： 175-187.

[21] 郑碧娟， 陈世品， 陈 辉， 等. ‘闽48和‘闽43油茶自交与异交花粉管的荧光显微观察[J]. 福建林学院学报， 2014， 34（1）： 1-4.