表面活性剂辅助提取沙棘叶黄酮工艺优化及其抗氧化活性测定

史豆豆++李萌++苏宁++孙啸涛++何如霞++王昌涛

摘要：通过单因素试验优化表面活性剂辅助提取沙棘（Hippophae rhamnoides L.）叶中黄酮的提取工艺，并且对粗提液的抗氧化活性进行测定。结果表明，表面活性剂辅助提取沙棘叶黄酮的最佳提取工艺为选用0.02 g/mL的蔗糖酯作表面活性剂、乙醇体积分数5%、提取温度70 ℃、料液比1∶70（g∶mL）、提取时间1.5 h，此条件下黄酮提取率为1.6%。黄酮粗提液对超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基有明显的清除作用。

关键词：沙棘（Hippophae rhamnoides L.）叶；黄酮；表面活性剂；抗氧化活性

中图分类号：S793.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）09-1726-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.09.031

Process Optimization and Anti-oxidation Evaluation of Total Flavonoids from Hippophae rhamnoides L. Leaves by Surfactant

SHI Dou-dou1a，LI Meng1a，SU Ning2，SUN Xiao-tao1b，HE Ru-xia1a，WANG Chang-tao1a，c

（1a.Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development；1b. Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry；1c.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Technology and Business University， Beijing 100048，China；

2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Cosmetics Technology Center， Beijing 100048，China）

Abstract： The extraction technology of total flavonoids from Hippophae rhamnoides L. leaves was optimized by single factor experiment，and the flavonoids content，the antioxidant activity of crude extract were determined. The results showed that the optimum extraction conditions were ethanol concentration 5%，extraction temperature 70 ℃，ratio of solid to liquid 1∶70（g∶mL）， extraction time 1.5 h，the concentration of surfactants was 0.02 g/mL. Under this condition， the extraction rate of flavonoids was 1.6%. The superoxide anion，OH·free radical， DPPH free radical scavenging effect.

Key words： Hippophae rhamnoides L. leaves； flavonoids； microorganism； antioxidant activity

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）是胡颓子科沙棘属植物，灌木或亚乔木落叶树种，又名黑刺、醋柳、酸刺等，是一种小浆果植物[1]，是中国古代藏医、蒙医治病的常用药[2]。沙棘叶作为沙棘果种植的副产品被废弃，但其中黄酮类物质含量丰富，主要成分为槲皮素、异鼠李素、山奈酚及其苷类、杨梅酮、氯原酸、猪草苷、儿茶酸、黄芪苷等[3]，具有重要的开发价值。

蔗糖脂肪酸酯简称蔗糖酯（Sucrose Esters，简称SE），是一种新型的多元醇型非离子型表面活性剂。蔗糖酯具有良好的乳化、分散、增溶、润滑、渗透、起泡、黏度调节、防老化、抗菌等性能[4]。同时，它还具有无毒、易生物降解等特性。现已被批准作为食品添加剂。本研究借助蔗糖酯的增溶作用[5]，通过单因素试验优化表面活性剂辅助提取沙棘叶中总黄酮的提取工艺，并且对粗提液进行黄酮含量及抗氧化活性的测定，以期提高沙棘黄酮提取率。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

供试材料：沙棘叶（青海康普生物科技有限公司）粉碎后用50目筛筛选，60 ℃下烘干至恒重备用。

试剂：芦丁标准品（生化试剂，中国药品生物制品检定所）；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）购自美国Sigma公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为市售国产分析纯；Tris-HCl缓冲液（弱堿性）、邻苯三酚溶液、HCl溶液、H2O2、FeSO4、水杨酸、蔗糖脂肪酸酯等。

仪器：UVmini-1240型紫外可见分光光度计（日本岛津制作所），水浴恒温摇床、全温度震荡培养箱（太仓华美生化仪器厂），恒温水浴锅、分析天平、称量天平、ZN-04B型小型粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司），低速大容量台式离心机、DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥机（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 表面活性剂辅助法提取沙棘叶黄酮 量取150 mL 25%乙醇，按照1∶70的料液比（g∶mL，下同）加入沙棘叶粉末，再加入3 g表面活性剂，在50 ℃下提取0.5 h，4 800 r/min离心，取上清液待测。

供试表面活性剂：十二烷基硫酸钠（AS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、双（2-乙基己基）磺基丁二酸钠（AOT）、十二烷基三甲基氯化铵（DTAC）、十二烷基磺酸钠（SDS）、聚氧乙烯月桂醚（Brij-35）、吐温-20（Tween-20）、曲拉通X-100（X-100）和两种生物表面活性剂（鼠李糖脂、蔗糖酯）。

1.2.2 芦丁标准曲线回归方程的建立 准确配制浓度为1 mg/mL的芦丁标准液，精确吸取体积为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的芦丁标准液，将体积补齐至1 mL，各加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min后，再加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀后，放置6 min，加入1 mol/L的NaOH溶液4 mL，再加0.4 mL的水，摇匀后，放置10 min，以空白试剂为对照，在波长510 nm条件下测定溶液吸光度。以芦丁浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。对芦丁标准液的浓度和吸光度A510 nm进行线性回归处理，计算得到回归方程：Y=1.378 7x-0.002 7，R2=0.999 5。

1.2.3 黄酮提取率测定 准确吸取1 mL的粗提液，按照“1.2.2”的方法测定粗提液吸光度，由标准曲线计算出粗提液中黄酮的浓度。

黄酮提取率=粗提液中黄酮浓度×粗提液总体积/原料质量×100%。

1.2.4 单因素试验 选取蔗糖酯加入量、料液比、乙醇体积分数、提取温度、提取时间5个因素进行单因素试验，考察这5个因素对蔗糖酯辅助法提取沙棘叶黄酮提取率的影响，以提取率为衡量指标，确定表面活性剂辅助法提取沙棘叶黄酮的最佳工艺条件。

1）蔗糖酯加入量对沙棘叶黄酮提取率的影响。量取150 mL 5%乙醇，按照1∶70的料液比（g∶mL，下同）加入沙棘叶粉末，再加入1、2、3、4、5、6、7 g蔗糖酯，在50 ℃下提取0.5 h，4 800 r/min离心，取上清液待测。

2）料液比对沙棘叶黄酮提取率的影响。量取150 mL 5%乙醇，按照1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、 1∶80的料液比加入沙棘叶粉末，再加入3 g蔗糖酯，50 ℃下提取0.5 h，4 800 r/min离心，取上清液待测。

3）乙醇体积分数对沙棘叶黄酮提取率的影响。量取150 mL 5%、10%、20%、30%、40%、60%乙醇，按照1∶70的料液比加入沙棘叶粉末，再加入3 g蔗糖酯，在50 ℃下提取0.5 h，4 800 r/min离心，取上清液待测。

4）提取温度对沙棘叶黄酮提取率的影响。量取150 mL5%乙醇，按照1∶70的料液比加入沙棘叶粉末，再加入3 g蔗糖酯，在40、50、60、70、80 ℃下提取0.5 h，4 800 r/min离心，取上清液待测。

5）提取时间对沙棘叶黄酮提取率的影响。量取150 mL 5%乙醇，按照1∶70的料液比加入沙棘叶粉末，再加入3 g蔗糖酯，在70 ℃下提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，4 800 r/min离心，取上清液待测。

1.2.5 验证试验 在最佳工艺条件下，测定沙棘叶黄酮提取率，3次重复，取平均值。

1.2.6 粗提液抗氧化活性的测定

1）对超氧阴离子清除作用。取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 mL于试管中，置于25 ℃水浴中预热20 min；分别加入1 mL不同浓度的试样和0.4 mL，25 mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚（由10 mmol/L HCl配制），混匀后于25 ℃水浴中反应5 min；加入8 mol/L盐酸1.0 mL终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 mL去离子水代替样品试液，在299 nm处测定吸光度，计算清除率。空白对照组以1 mL试样溶剂代替样品，每个处理均3次重复。

清除率=（A1-A2）/A1×100%

式中，A1为空白吸光度，A2为试样吸光度。

2）对羟自由基清除作用。在试管中依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4，2 mL不同稀释倍数待测样品，2 mL 6 mmol/L H2O2，摇匀，室温静止10 min。再加入2 mL 6 mmol/L水杨酸，摇匀，于37 ℃水浴加热30 min后取出，测定其吸光度Ai；在试管中依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4，2 mL不同稀释倍数待测样品，2 mL 6 mmol/L H2O2，摇匀，室温静止10 min，再加入2 mL去离子水，摇匀，于37 ℃水浴加热30 min后取出，测定其吸光度Aj；在试管中依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4，2 mL去离子水，2 mL 6 mmol/L H2O2，摇匀，室温静止10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水杨酸，摇匀，于37 ℃水浴加热30 min后取出，测定其吸光度A0。

清除率=[（A0+Aj）-Ai]/A0×100%

3）對DPPH自由基清除作用。取等体积（一般为3 mL）的待测液与2×10-4 mol/L的DPPH溶液混匀（A1管）；取等体积的无水乙醇（待测物溶剂）与2×10-4 mol/L的DPPH溶液混匀（A2管）；取等体积的无水乙醇与待测液混匀（A3管）；反应30 min后，在517 nm下测A1、A2、A3管吸光度[6]。

清除率=[（A2+A3）-A1]/A2×100%

2 结果与分析

2.1 表面活性剂种类对沙棘叶黄酮提取的影响

表面活性剂种类对沙棘叶黄酮提取的影响如图1所示。由图1可知，分别用表面活性剂Brij-35、AS、蔗糖酯、SDS、AOT、鼠李糖酯、5%乙醇、X-100、Tween-20、CTAB、DTAC辅助提取沙棘叶黄酮时，提取率逐渐降低；当使用X-100、Tween-20、CTAB和DTAC辅助提取时，黄酮提取率低于5%乙醇辅助提取时的提取率，因此，这4种表面活性剂除了不能促进沙棘叶黄酮的提取，反而对其有抑制作用，故选用蔗糖酯为最合适的表面活性剂。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 蔗糖酯加入量对沙棘叶黄酮提取的影响 不同蔗糖酯添加量对沙棘叶黄酮提取率的影响如图2所示。当溶液总体积为150 mL，在蔗糖酯加入量小于5 g时，其沙棘叶黄酮提取率逐渐增加，且在5 g时达到峰值，而高于5 g之后提取率明显下降，故蔗糖酯加入量为5 g最为适宜。

2.2.2 料液比对沙棘叶黄酮提取的影响 料液比对蔗糖酯辅助提取沙棘叶黄酮的影响如图3所示。当料液比为1∶60、1∶70、1∶80时沙棘叶黄酮提取率比较理想，且在1∶70时候达到峰值，在此之前随着料液比的增加提取率呈上升趋势；当提取率大于1∶70时，沙棘叶黄酮提取率呈明显的下降趋势，故选用 1∶70为最佳料液比。

2.2.3 乙醇体积分数对沙棘叶黄酮提取的影响 乙醇体积分数对提取沙棘叶黄酮提取率的影响如图4所示。当乙醇体积分数为5%时，沙棘葉黄酮的提取效率最高，此后随着乙醇体积分数的升高提取率反而降低，当乙醇体积分数达到40%时，提取率才有所回升，但回升幅度较低。因此，选用5%为最佳乙醇体积分数。

2.2.4 提取温度对沙棘叶黄酮提取的影响 提取温度对提取沙棘叶黄酮提取率的影响如图5所示。当提取温度达到70 ℃时，沙棘叶黄酮提取率达到峰值；当提取温度小于40 ℃时提取率明显降低，当提取温度高于70 ℃时，提取率也呈降低趋势，故选用70 ℃为最加提取温度。

2.2.3 提取时间对沙棘叶黄酮提取的影响 提取时间对提取沙棘叶黄酮提取率的影响如图6所示。沙棘叶黄酮提取率在提取时间为1.5 h的时达到峰值，2.0 h时提取率有明显回落，但当提取时间延长至2.5 h时，提取率又有所增长。因此，选用1.5 h为最佳时提取时间。

2.3 验证试验

在最佳工艺条件下，即150 mL 5%乙醇，按照1∶70的料液比加入沙棘叶粉末2 g，再加入5 g蔗糖酯，在70 ℃下提取1.5 h，4 800 r/min离心，取上清液测定沙棘叶黄酮提取率，3次重复，取平均值。结果表明，沙棘叶黄酮提取率为1.6%。

2.4 沙棘叶黄酮粗提液的抗氧化活性

2.4.1 沙棘叶黄酮粗提液对超氧阴离子的清除作用 从图7中可以看出，沙棘黄酮粗提液对超氧阴离子有明显的抑制作用，粗提液对超氧阴离子自由基的清除作用随粗提液稀释倍数增大而呈下降趋势。粗提液稀释倍数越大，粗提液对超氧阴离子自由基的清除作用越小。

2.4.2 沙棘叶黄酮粗提液对羟自由基的清除作用 从图8中可以看出，沙棘黄酮粗提液对羟自由基的清除作用随粗提液稀释倍数增大呈先上升后下降的趋势，粗提液稀释倍数越小，粗提液对羟自由基的清除作用越明显，在粗提液稀释倍数达到1.25倍时，清除作用达到最大值。

2.4.3 沙棘叶黄酮粗提液对DPPH自由基的清除作用 沙棘黄酮粗提液对DPPH自由基的IC50值为1.16%。从图9中可以看出，沙棘黄酮粗提液对DPPH的清除作用随粗提液稀释倍数的变化呈下降趋势，沙棘黄酮粗提液的稀释倍数越大，粗提液对DPPH自由基的清除作用越小，当沙棘黄酮粗提液的稀释倍数达到80倍后，抑制作用趋于最小值，之后变化较小。

3 小结

利用表面活性剂蔗糖酯通过在其表面、界面的吸附作用或在溶液中形成的分子聚合体而改变黄酮类物质在水溶液中的溶解性，提高了沙棘叶黄酮的提取率。蔗糖酯辅助法在提高沙棘叶黄酮提取率的同时，也是一种绿色环保、高效、快速的沙棘叶黄酮提取方法。

蔗糖酯辅助提取沙棘叶黄酮，得到的黄酮粗提液具有较强的抗氧化活性。沙棘叶黄酮粗提液对DPPH自由基的IC50值为1.16%，对超氧阴离子、羟自由基也有较明显的清除作用。本试验旨在探索提取沙棘叶黄酮的新方法，试验证明这种新方法可行，且黄酮提取率较高，对沙棘叶黄酮应用于化妆品领域提供了参考。

参考文献：

[1] 刘树英，郑 涛，刘俊男，等.沙棘黄酮提取方法比较研究[J].安徽农业科学，2009，37（24）：11551-11552，11557.

[2] ROSTRUP-NIELSEN J R. Sulfur-passivated nickel catalysts for carbon-free steam reforming of methane[J].Journal of Catalysis，1984，85（1）：31-43.

[3] 王华亭，王树美，张维东.醋柳黄酮的实验研究及临床应用进展[J].医学与哲学，2008，29（7）：53-56.

[4] 陈瑞祯.蔗糖脂肪酸酯及其在糖厂煮糖中的应用[J].甘蔗糖业，1986（3）：12-13.

[5] 王昌涛，张佳婵，孙啸涛，等.鼠李糖脂/蔗糖酯辅助乙醇提取沙棘籽黄酮的工艺条件及初步鉴定[J].食品科学，2014，35（2）：62-68.

[6] 张佳婵，谢娅霏，虞 旦，等.玫瑰花及花渣中黄酮类物质的提取及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2014，35（22）：226-230.