几株内生真菌对三峡地区柑橘的生物保鲜作用

秦王阁阁++蒋维++黄炜诚++薛艳红++刘士平

摘要：从三峡地区自然腐烂的柑橘果实上分离出1株优势致腐菌，经rDNA-ITS序列分析和形态学观察，鉴定该菌为Penicillium citrinum。用来自三峡地区特有灌木疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）的12株具较高抗氧化活性内生真菌，分析其对柑橘致腐菌的拮抗作用。结果表明，其中4株具有较好的拮抗效果，菌株SG-4的发酵液水相粗提物的抑菌活性最好，在柑橘中亦可抑制致腐菌生长，自然贮藏过程中有效阻止柑橘果实腐烂，说明可在三峡地区柑橘的生物保鲜中进行推广和利用。

关键词：内生真菌；柑橘；抗氧化；生物保鲜

中图分类号：S666；S609+.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）09-1717-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.09.029

Biopreservation of Several Endophytes to the Citrus in Three Gorges Region

QINWANG Ge-ge， JIANG Wei， HUANG Wei-cheng， XUE Yan-hong， LIU Shi-ping

（College of Life Science and Pharmacy， Three Gorges University， Yichang 443002， Hubei，China）

Abstract： A dominant fungus caused citrus rot was isolated from the naturally decaying fruit in the Three Gorges area. Through rDNA-ITS sequence and morphology analysis， the strain was identified as Penicillium citrinum. 12 endophytic fungi with high antioxidant activity from Myricaria laxiflora，a specific shrub in the Three Gorges area，were chosen to evaluate the antagonism to the citrus rot fungi. The results displayed that 4 endophytic fungi had good antagonistic activity. The aqueous phase crude extracts from SG-4 broth showed the best antifungal activity， which can inhibit the rot fungi growth in citrus fruit and effectively prevent the decay in natural storage. All the endeavors indicated that the endophytic fungi can be promoted and used in the biopreservation of citrus in the Three Gorges region.

Key words： endophytic fungi； citrus； antioxidant； biopreservation

三峽地区是中国优质柑橘的主产区之一，桔、柑、橙、柚总种植面积逾26.7万hm2，是当地的重要支柱产业[1]。但是柑橘采后鲜果集中上市，果实又迅速发生后熟，季节性供过于求导致大量的柑橘腐烂，造成巨大的经济损失[2]。霉菌的生长、氧化和失水是影响柑橘贮藏的主要因素[3]，传统上使用冷藏、气调、打蜡等工艺进行防腐保鲜，但这些方法有些成本高，有些有副作用影响果品的品质[4]。生物保鲜法为解决上述问题提供了新的契机。一些细菌、酵母或丝状真菌作为柑橘致腐菌的拮抗剂，配合一些植物次生代谢产物（主要作为抗氧化剂）能有效控制果实的采后病害[5-7]，能保持原有风味和营养，贮藏条件易控制，处理费用低，污染小，是果品贮运保鲜的重要发展方向[8]。

为筛选到合适的拮抗菌，本研究首先分离鉴定了三峡地区柑橘优势致腐菌，然后从特异分布在三峡河岸带地区常年受淹水胁迫（氧化胁迫）的疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）上[9，10]，筛选出12株抗氧化活性较高的内生真菌，分析其对柑橘致腐菌的拮抗作用和果实保鲜作用，获得一株抗氧化活性较高，同时又具备较高拮抗活性的内生真菌SG-4，为柑橘生物保鲜和采后病害防治奠定基础。

1 材料和方法

1.1 疏花水柏枝高抗氧化活性内生真菌筛选

选取12株在淹水胁迫前后有氧或无氧条件下从疏花水柏枝的根、茎、叶中分离得到的内生真菌进行拮抗菌的筛选，经总抗氧化能力测定，其抗氧化活性均大于15 U/mL，18S ITS序列比对后确定到属，具体菌株信息见表1。

1.2 柑橘优势致腐菌的分离与鉴定

从自然条件下完全腐烂的三峡地区柑橘果实中挑取孢子接种于马铃薯培养基（PDA）中，28 ℃培养7 d，多次划线分离纯化，具体分离鉴定程序参考孔玉珊等[2]的方法。

1.3 菌株致病性检测

将菌株用无菌水制成1×105 CFU/mL的菌悬液，柑橘果实用2%次氯酸钠溶液消毒2 min，清水洗净，在柑橘果实上刺4个直径3 mm、深3 mm的伤口，在伤口处接种20 μL孢子悬浮液，晾干，于28 ℃培养观察果实发病情况。根据柯赫氏法则[11]，检测菌株的致腐菌。

1.4 内生菌对致腐菌的抑菌作用

从4 ℃冰箱中取出高抗氧化活性内生真菌，接种到PDA平板上，28 ℃培养7 d。将致腐菌接种于PDA液体培养基中，待菌丝球产生后接种到PDA斜面上，28 ℃培养3 d，加入9 mL无菌水，刮下孢子，取500 μL孢子悬液涂布在PDA培养基上。用打孔器取内生菌菌饼，接种于涂布致腐菌的平板上，28 ℃恒温培养2 d，测量抑菌圈直径。

提取内生真菌发酵液粗提物时，先将内生真菌接种到150 mL PDA液体培养基中，28 ℃培养7 d。真空抽滤分离发酵液与菌体，菌体用等体积70%丙酮浸提24 h，重复3次过滤取滤液。滤液用乙酸乙酯等体积萃取，得到三部分分别为菌体相、水相和乙酸乙酯相。水相在55 ℃、0.1 MPa下旋蒸至黏稠状，收集待用。菌体相与酯相在42 ℃、0.1 MPa下旋蒸至黏稠状收集。将致腐菌接种到PDA斜面培养基上，28 ℃下培养3 d。在试管中加10 mL无菌水，用接种环刮下所有孢子。在PDA平板表面加入400 μL稀释10倍的柑橘致腐病菌孢子菌悬液，涂布均匀。将牛津杯立在培养基表面，每个牛津杯滴入150 μL 10倍稀释的真菌提取物，观察抑菌作用。以0.2 mg/L化学保鲜剂咪鲜抑霉唑为正对照，28 ℃培养3 d。

1.5 柑橘贮藏试验

柑橘洗净后，刺4个直径3 mm、深3 mm的伤口，在伤口处接种100 μL柑橘致腐菌孢子悬浮液，空白组用清水涂抹柑橘表面，试验组用真菌提取物稀释10倍涂抹，晾干，28 ℃培养观察果实发病情况。自然贮藏时选取体形大小、成熟度基本一致、无病虫和机械损伤的宜昌本地柑橘果实，7个为一组用不同方法保存。贮藏后30 d进行第1次调查， 以后每隔15 d调查1次，共查3次。烂果率=烂果数÷调查总果数×100%，防腐效果=（空白组烂果率-对应处理烂果率）÷空白组烂果率×100%。

2 结果与分析

2.1 三峡地区柑橘优势致腐菌

取宜昌地区生产的柑橘，自然贮藏，分离到两株优势致腐菌，其中一株鉴定为镰刀菌（Fusarium sp.）[2]，另一株命名為G-1，在PDA培养基上菌落呈绒状，形状不规则，疏松，生长较快；菌丝体为白色，之后形成灰绿色霉层，边缘菌丝带白色，较宽，基质颜色为白色。显微镜检观察其分生孢子串生，呈椭圆形，菌丝分枝且具有横隔（图1）。其18S ITS序列（登录号KX599232）与已报道的橘青霉（Penicillium citrinum）同源性高达100%，进化树分析表明（图2），该菌是一株橘青霉。

为进一步明确所分离的橘青霉是否是造成三峡地区柑橘采后腐烂的优势菌，将菌株接种在柑橘果实上2 d后进行观察，在伤口周围形成约2 cm的病斑，果皮变软，之后病斑快速扩大，全果变软，表皮开始长出白色菌体，之后生长出大量的分生孢子，最后形成灰绿色霉层，果皮变为褐色，故判断所分离得到的橘青霉与先期分离的镰刀菌一样，均为三峡地区柑橘采后的致腐菌（图3）。

2.2 疏花水柏枝内生菌菌株对致腐菌的抑菌作用

为了从疏花水柏枝内生真菌中筛选到对柑橘致腐菌有拮抗作用的菌株，采用抑菌圈法分析了内生真菌对2株柑橘致腐优势菌的拮抗作用。结果表明，在12株高抗氧化活性的内生菌中，有4株内生真菌具有较好的拮抗效果，分别为HY-1、HG-2、SG-4、SG-17，其中SG-4抑菌活性最明显（表2）。

2.3 内生真菌发酵液粗提物对致腐菌的抑菌作用

为了进一步明确HY-1、HG-2、SG-4、SG-17这4株内生菌发挥抑菌作用的机理，采用抑菌圈法分析了内生菌发酵液粗提物对致腐菌的拮抗作用。结果表明，只有各内生真菌发酵液水相粗提物对柑橘致腐菌有明显的抑菌作用，说明抗菌物质存在于各内生真菌发酵液水相粗提取物中，且SG-4发酵液水相粗提物对致腐菌的抑制效果明显优于其他菌株（表3，图4）。

为了探究内生真菌对柑橘果实的保鲜作用，分析了SG-4发酵液粗提物对柑橘接种橘青霉致腐菌后的抑菌作用。结果表明，空白组柑橘果实接种致腐菌橘青霉9 d后，全果变软，表皮上形成灰绿色霉层，果皮变为褐色，果实腐烂。试验组柑橘果实涂抹SG-4发酵液水相粗提物并接种橘青霉9 d后，仅在伤口周围形成少许白色菌体。由此可证明，SG-4发酵液水相粗提物能较好地抑制柑橘果实中橘青霉的生长，有效阻止柑橘果实的腐烂（图5）。

2.4 柑橘自然贮藏中的保鲜作用

为了分析SG-4粗提物对自然贮藏下柑橘的保鲜作用，采用SG-4粗提物液体浸果，配合保鲜膜的保水作用，对不同贮藏时期的柑橘保鲜效果进行了分析。结果表明，柑橘在室温下分别贮藏30、45、60 d后，SG-4粗提物浸果能有效抑制柑橘橘青霉、镰刀菌等致腐菌的生长，从而达到柑橘保鲜的效果（表4）。

在柑橘自然贮藏过程中，添加保鲜膜可以有效防止水分的蒸发，起到保持水分和新鲜度的作用。但从上述试验结果可以看出（表4），保鲜膜对于柑橘防止致腐菌的感染没有作用，出现添加保鲜膜后其腐烂率增加的现象，不管是空白组还是添加SG-4粗提物后表现出类似的趋势，表明适度的低氧水平可能会促进柑橘致腐菌的生长。但是，不管是否添加保鲜膜，与空白组相比，SG-4提取物对柑橘致腐菌都有很好的抑制作用，且SG-4粗提物液体浸果+保鲜膜和正对照咪鲜抑霉唑的防腐效果相当，表明SG-4可以配合保鲜膜等保水措施来共同延长柑橘的保鲜期。

3 小结与讨论

从自然发病的完全腐烂的宜昌本地柑橘果实上分离出1株优势致腐菌，经rDNA-ITS序列分析表明该菌为Penicillium citrinum。采用抑菌圈法分析了12株三峡地区本地物种疏花水柏枝内生真菌对柑橘致腐菌的拮抗作用，结果表明在12株内生真菌中，有4株具有较好的拮抗效果，分别为HY-1、HG-2、SG-4、SG-17。其中SG-4显示出较好的抑菌活性，对三峡地区柑橘的生物保鲜和防腐发挥作用。

采用抑菌圈法分析了内生真菌HY-1、HG-2、SG-4、SG-17发酵液水相粗提物对柑橘致腐菌的拮抗作用，结果表明4株内生真菌发酵液的水相粗提物对致腐菌有很好的抑制作用，其中SG-4效果最佳。采用柑橘实体贮藏试验分析了内生真菌发酵液水相粗提物对柑橘的保鲜作用，结果表明SG-4发酵液水相粗提物能较好地抑制致腐菌的生长，阻止柑橘果实腐烂，且在室温下保存60 d后，SG-4粗提物浸果仍能有效地抑制自然储存条件下柑橘致腐菌的生长。

今后还需进一步明确内生真菌起拮抗作用的物质基础，根据活性跟踪分离得到高拮抗活性的化合物，将相关工艺进一步优化，为研发新型柑橘生物保鲜剂等提供依据。

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