青霉素废菌渣微波水解制备复合氨基酸及应用

张蒙蒙，赵风清



青霉素废菌渣微波水解制备复合氨基酸及应用

张蒙蒙1，赵风清1，2

（1河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄 050018；2河北省固体废弃物工程技术研究中心，河北 石家庄 050018）

青霉素废菌渣是制药工业青霉素发酵工序产生的固体废弃物，处理不当会导致环境污染、危及生态。本文以废菌渣为原料，在碱性条件下，采用微波水解方法得到复合氨基酸。将其作为石膏缓凝剂，可以实现废菌渣的安全、高附加值利用。在单因素实验的基础上，以碱浓度、料液比、反应时间、反应温度为考察因素，采用正交实验法确定最佳工艺条件为：碱浓度0.04mol/L，料液比1∶4，微波水解时间10min，温度85℃。借助氨基酸分析仪分析了水解产物的化学组成，利用红外光谱、扫描电镜等手段对缓凝作用（石膏体系）机理进行了分析研究。结果表明：水解物主要是赖氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等氨基酸的混合物，其中氨基和羧基官能团参与了钙的配位，形成了钙的复合氨基酸/小肽螯合物，从而延缓了石膏的溶解、水化和结晶过程，使凝结时间延长。

废菌渣；石膏缓凝剂；微波；蛋白质；水解；复合氨基酸；肽

中国是一个抗生素生产大国，发酵类药物产品产量位居世界第一[1]。据统计，我国年产青霉素大约有10万吨，其中青霉素工业盐年产量占全世界总产量的75%。青霉素废菌渣是青霉素生产过程中提取发酵液后产生的废渣，每生产1t青霉素的原料药产生8～10t的新鲜菌渣。青霉素废菌渣中含有一定量的抗生素及其他有毒代谢产物[2]，处理不当会造成严重的环境问题和安全问题，属危险废弃物，其处理处置已经成为制约相关生产企业的一大难题。传统的处理方法包括焚烧、填埋以及作为有机肥料或饲料添加剂。焚烧处理会造成氮氧化物的排放，严重污染大气环境；填埋或者作为有机饲料会使菌渣中残留的有毒物质污染地下水和植物，经过食物链转移到人体，造成抗生素的滥用，危害人体健康[3]，近些年来已被明令禁止。

研究发现，青霉素废菌渣中含有一定数量的蛋白质、纤维素、脂肪，还有多种酶等物质，可用来发酵制取沼气[4]，作为能源利用，剩余的残渣用作肥料。但是，仍然存在抗生素污染土壤的风险。鉴于青霉素菌丝体元素分析含碳量高达44.08%，刘波文等[5-6]开发制备活性炭工艺。但是，利用青霉素废菌渣直接制备活性炭会产生氮氧化物等有害气体，造成大气环境污染。也有一些学者利用青霉素菌渣中的活性物质（如蛋白质、甲壳素、麦角固醇）开发了菌渣破壁工艺[7-9]、壳聚糖提取工艺[10]、麦角固醇提取工艺[11-12]，但是工艺比较复杂，难以实现工业化生产，预期经济效益较低。河北科技大学任晓琼等[13]采用水浴加热法水解青霉素废菌渣制备石膏缓凝剂，对水解物与常用石膏缓凝剂进行了对比研究，产品缓凝性能良好。但该工艺反应时间较长，水解效率较低。此外，对于水解产物组成以及缓凝作用机理未给出明确的定论。

本文采用微波和碱协同的手段强化青霉素废菌渣的水解反应制备复合氨基酸，将其用作石膏缓凝剂，实现青霉素废菌渣安全、清洁利用。其次，考察不同因素对石膏凝结时间影响，并借助化学分析以及全自动氨基酸分析仪、红外图谱、扫描电镜等手段，分析水解产物的主要成分，研究缓凝作用机理，为工艺设计与优化提供技术基础。

1 实验

1.1 主要试剂

氢氧化钠，天津市风船化学试剂科技有限公司；甲醛溶液，天津市百世化工有限公司；蒸馏水，自制；青霉素废菌渣，华北制药股份有限公司；脱硫建筑石膏，石家庄市旭昊建材有限公司，由烟气脱硫石膏煅烧制得。产品符合GB/T9776—2008，质量稳定。表1、表2分别给出了脱硫建筑石膏的主要化学组成和力学性质。

表1 脱硫建筑石膏主要化学成分 单位：%

表2 脱硫建筑石膏物理力学性能

1.2 实验方法

1.2.1 复合氨基酸缓凝剂的制备

将青霉素废菌渣干燥、粉碎。按照一定料液比与碱液混合，制成菌渣悬浮液。设定微波功率为480W，通过改变碱浓度、料液比、微波处理时间和水解反应温度条件进行水解反应，反应完成后将水解液8000r/min下离心分离15min，取上清液即得到复合氨基酸缓凝剂。

1.2.2 复合氨基酸缓凝剂制备工艺优化

采用1.2.1节工艺，分别考察碱浓度（0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.035mol/L、0.04mol/L）、料液比（废菌渣与碱溶液的质量比为1∶3、1∶4、1∶6、1∶7、1∶8、1∶10、1∶12）、微波处理时间（3min、5min、7min、10min、12min）和温度（35℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃）等因素对缓凝剂中氨基酸含量及石膏体系凝结时间的影响，通过系统实验确定最佳水解工艺条件。

1.2.3 性能测试

缓凝剂氨基酸含量测试：根据《GB/T 5009.39—2003》采用甲醛滴定法对氨基酸态氮进行含量测试。

脱硫建筑石膏性能测试：依据《GB/T 17669.4—1999建筑石膏净浆物理性能的测定》对脱硫建筑石膏进行标准稠度需水量、凝结时间测试；依据《GB/T 17669.3—1999建筑石膏力学性能的测定》对建筑石膏进行抗折、抗压强度测试。

1.2.4 表征方法

扫描电镜分析：硬化体样品在模具中成型，脱模后破粹成约5mm的试块，并立即浸泡在无水乙醇中3天，以终止其水化，然后在40℃烘箱中烘干至恒重，用毛细管吸取适量样品置载玻片，断面镀金用扫描电镜观察晶体形态。

红外光谱分析：在等电点条件下用乙醇析出复合氨基酸及其钙的螯合物，再用乙醇进一步纯化，通过过滤、真空干燥等工序得到复合氨基酸及螯合物固体。分别取少量复合氨基酸和复合氨基酸螯合物于研钵中，分别加入KBr粉末研磨混合均匀，压片，用傅里叶红外光谱仪扫描其4000～500cm–1范围内的红外吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 碱浓度对水解反应的影响

废菌渣的细胞壁在碱性条件、微波辐射下极不稳定，细胞壁破坏释放菌体蛋白。碱浓度的高低直接影响着水解反应的程度，高碱度能破坏蛋白质间的肽键，经过多肽和二肽一系列中间产物，最后变成游离的氨基酸。实验过程中，设定料液比为1∶6，反应温度75℃，在碱浓度为0.01～0.04mol/L的条件下菌渣水解10min。分析氨基酸态氮含量，测定用于石膏体系的凝结时间。见图1。

从图1可以看出，随着碱液浓度的增大，氨基酸态氮含量逐渐升高。在实验范围内，碱液浓度越高，水解越完全。研究中也发现，随着碱浓度的提高水解液黏度逐渐增高，不利于后续过滤分离。另外，过高的碱浓度会造成碱的浪费也会对氨基酸造成明显的破坏。碱浓度为0.01～0.04mol/L的条件下，复合氨基酸用于石膏体系时凝结时间达到55～90min。结果表明：在碱浓度为0.035mol/L时复合氨基酸产率较高，此时，对脱硫石膏缓凝效果也较为理想。

2.2 料液比对水解反应的影响

固定碱浓度为0.035mol/L，温度为75℃，反应时间10min，改变料液比，制备复合氨基酸水解液，分别测定不同样品用于石膏体系的凝结时间，得到水解液氨基酸态氮含量及凝结时间随料液比的变化规律，见图2。

实验结果显示，在考察范围内，随着料液比降低，氨基酸态氮含量逐渐降低，凝结时间也逐步缩短。在碱液量固定的条件下，料液比越低，菌渣掺量越少，有效成分越少，所以复合氨基酸含量越低。显然，复合氨基酸对于石膏缓凝具有重要作用。

2.3 微波处理时间对水解反应的影响

从图3可以看出，随着微波水解时间的延长，氨基酸态氮含量缓慢增加。当水解时间大于10min时，氨基酸态氮含量有下降趋势。这是由于微波加热的高效性，微波辐射在短时间对菌渣细胞的破壁效果明显，从而使胞内菌体蛋白大量溶出，菌体蛋白在短时间快速水解。实验条件下，石膏的凝结时间随着微波辐射时间增加呈现先增加、后缩短的趋势，初凝介于87～93min之间，而适宜的水解时间为10min左右。

2.4 反应温度对水解反应的影响

温度对废菌渣水解反应速度具有重要影响。固定碱性浓度为0.035mol/L，料液比为1∶6，在不同反应温度下水解10min，研究水解产物中氨基酸态氮含量以及石膏体系凝结时间变化规律，见图4。

结果表明，随着温度越高，氨基酸态氮含量和凝结时间均呈增长的趋势。当反应温度高于75℃时，变化趋缓。温度越高，反应速率越快，有利于细胞壁的破壁和蛋白质的水解。

2.5 正交实验

综合上述单因素实验结果，结合理论分析，确定正交实验因素与水平，以双目标（氨基酸态氮含量和用于石膏体系的凝结时间）进行优化实验。表3给出了正交实验因素和水平表，表4、表5给出了正交实验结果。

由表4、表5极差分析可知，无论以氨基酸态氮含量为目标，还是以脱硫石膏初凝时间为目标，各因素影响次序均为＞＞＞，而且两者优化的因素/水平组合均为3123，这也进一步验证了氨基酸态氮含量和脱硫石膏初凝时间是一致的。

2.6 验证实验

对正交实验优化因素/水平组合进行验证实验，结果见表6。

验证实验结果说明，正交实验得到的优化因素/水平组合响应优于其他组合。据此得到微波水解青霉素废菌渣制备石膏缓凝剂最佳工艺条件为：碱浓度0.04mol/L，料液比1∶4，微波辐射时间10min，反应温度85℃。在该工艺条件下，缓凝剂中氨基酸态氮含量为1.8021g/L，石膏的初凝时间达到245min（缓凝剂掺量为0.105%）。

表3 实验因素与水平表

2.7 缓凝剂对石膏力学性能的影响

选取石膏常用的缓凝剂柠檬酸、柠檬酸钠、六偏磷酸钠与WPM缓凝剂作对比（以凝结时间为基础），考察缓凝剂对脱硫石膏凝结时间及抗折、抗压强度的影响，结果见表7。

表4 正交实验实验结果1（氨基酸态氮含量为目标）

表5 正交实验实验结果2（脱硫石膏初凝时间为目标）

表6 验证实验实验数据

表7 不同缓凝剂对石膏力学性能的影响

结果表明：缓凝剂的加入，在延缓脱硫建筑石膏凝结时间的同时，也造成了一定的力学强度损失。与传统的缓凝剂相比，实验制备的复合氨基酸缓凝剂对脱硫建筑石膏具有良好的缓凝效果，强度损失较小，具有明显优势。

3 缓凝机理分析

3.1 缓凝剂中游离氨基酸含量

吸取缓凝剂1mL，定容到50mL的容量瓶中。取20μL稀释液，采用日立L-8900全自动氨基酸分析仪测定。得到17种氨基酸标样谱图见图5，缓凝剂中氨基酸含量分析结果见表8。

从表8可以看出，缓凝剂中的主要成分为赖氨酸、酪氨酸，还含有微量的甘氨酸、半胱氨酸等。这些产物α位上都有羧基和氨基，并且半胱氨酸脂肪族侧链上含有硫基。根据实验结果和分子结构分析，可以初步断定，羧基和氨基具有较强的螯合性能，这些基团的存在会促进石膏的 缓凝。

表8 缓凝剂中氨基酸含量

3.2 缓凝剂对脱硫石膏中钙离子的螯合性能

为了进一步分析、验证缓凝机理，参考“GB601—2002”设计了钙离子螯合实验，考察羟基、羧基等基团的螯合作用。首先配制EDTA溶液，标定浓度为0.0234mol/L。其次，按照水-石膏质量比10∶1混合均匀，水化一定时间后离心分离，取定量离心后的上清液体，采用滴定方法测定不同水化时间的钙离子浓度，以此判断缓凝剂在脱硫建筑石膏中的钙离子螯合性能[15-16]。

由图6可以看出，未掺缓凝剂的脱硫石膏水化时间小于15min时，钙离子含量迅速下降；水化时间大于15min，钙离子含量基本保持稳定。掺有0.105%复合氨基酸缓凝剂的脱硫石膏在水化时间小于100min时，钙离子含量缓慢降低；水化时间大于100min时，钙离子含量才趋于恒定。总之，在开始的一段时间内掺入缓凝剂的水化液中钙离子含量比空白石膏水化液中钙离子含量高，而且降低速度较为缓慢。原因在于，缓凝剂中酪氨酸、赖氨酸、半胱氨酸等氨基酸含有氨基和羧基等官能团，溶于水后对钙离子产生很强的螯合作用，形成的螯合物胶体附着于石膏粒子表面，延缓了半水石膏的溶解、水化过程和二水石膏的结晶，从而产生缓凝作用[17-18]。

Asp―天冬氨酸；Thr—苏氨酸；Ser—丝氨酸；Glu—谷氨酸；Gly—甘氨酸；Ala—丙氨酸；Cys—胱氨酸；Val—缬氨酸；Met—甲硫氨酸； Ile—异亮氨酸；Leu—亮氨酸；Tyr—酪氨酸；Phe—苯丙氨酸；Lys—赖氨酸；His—组氨酸；Arg—精氨酸； Pro—脯氨酸（NH3只代表样品处理过程中引入的氨气，不代表任何氨基酸）

3.3 钙的复合氨基酸/小肽的螯合物红外分析

菌渣蛋白属于单细胞蛋白，分子量较小，缓凝剂中游离氨基酸含量较多，也含有少量的小肽物质。分别取少量复合氨基酸/小肽和钙的复合氨基酸/小肽螯合物于研钵中，分别加入KBr粉末研磨混合均匀，压片，用傅立叶红外光谱仪得到4000～500cm–1范围内的红外吸收光谱，见图7。

复合氨基酸/小肽物质红外图谱（图7中a线）中3411.31cm–1是—NH的特征峰，1648.75cm–1是C=O的特征峰，1403.99cm–1是COO–的特征峰，1058.80cm–1是C—N的特征峰。在钙的复合氨基 酸/小肽螯合物的红外图谱（图7中b线）中，螯合后，C—N的吸收峰由原来的1058.80cm–1移动到了1129.69cm–1，C=O与COO–分别移至1622.59cm–1、1416.33cm–1，—NH的吸收峰明显减弱。说明—NH键、C=O键、COO—键都参与了钙离子的螯合反应。由此可以推测，与钙离子产生螯合作用的官能团主要为氨基和羧基。

3.4 缓凝剂对脱硫石膏微观结构的影响

石膏的凝结时间与微观结构密切相关，为了考察缓凝剂对石膏结晶过程的影响，借助扫描电镜对掺加复合氨基酸缓凝剂的脱硫建筑石膏浆体和空白样的微观结构进行了分析。

图8为未掺加缓凝剂的脱硫石膏浆体的微观形貌。可以看出，空白脱硫石膏晶体呈板块和细长针状，排列相互交错。图9为掺加0.105%缓凝剂的脱硫石膏浆体的微观形貌。其中，大部分晶体呈短柱形，也有小部分晶体呈片状，晶体之间没有明显的纵横交错结构。有理由认为，缓凝剂的使用阻滞了石膏晶体的发育进程。钙螯合物胶体会吸附在石膏晶核表面上，抑制了晶核的轴向生长，改变了石膏的形貌，减缓了石膏结晶速度，从而延长了石膏的缓凝时间。

4 结论

（1）利用微波加热与碱性水解的协同作用，使得废菌渣水解反应得到强化，大大缩短了水解时间，有效提高了水解反应效率。与传统的处理方式相比，利用青霉素菌渣制备石膏缓凝剂，可以有效降低了对环境的污染，实现了青霉素废菌渣安全、清洁利用。

（2）通过正交实验对青霉素菌渣水解制备石膏缓凝剂工艺进行了研究，得到适宜的条件：碱浓度为0.04mol/L，料液比为1∶4，反应时间为10min，反应温度为85℃。产品中氨基酸态氮含量为1.8021g/L，作为石膏缓凝剂使用时，初凝时间达245min（缓凝剂掺量为0.105%）。

（3）对缓凝剂中游离氨基酸进行了分析研究，结果表明：缓凝剂是多种氨基酸的混合物，其中以赖氨酸和酪氨酸为主，还含有少量的甘氨酸、半胱氨酸等。氨基酸的含量与对石膏的缓凝效果呈正相关特征。

（4）通过钙离子螯合实验以及钙的复合氨基酸/小肽的螯合物红外谱图分析，得出对石膏起缓凝作用的主要基团是氨基和羧基。借助扫描电镜对掺加复合氨基酸缓凝剂的脱硫建筑石膏和空白样进行的微观结构分析，间接证实氨基和羧基在水溶液中与钙离子形成的螯合物，抑制了石膏晶体的快速长大，延缓了石膏的凝结时间。

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Preparation and application of mixed amino acids from waste penicillin mycelium by microwave hydrolysis

ZHANG Mengmeng1，ZHAO Fengqing1，2

（1College of Chemical and Pharmaceutical EngineeringHebei University of Science & Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China；2Hebei Engineering Research Center of Solid Wastes Utilization，Shijiazhuang 050018， Hebei，China）

Waste penicillin mycelium（WPM）is solid waste from the fermentation process of penicillin in pharmaceutical industry，which will result in air pollution and threaten the ecological environment. WPM was treated by microwave hydrolysis in alkali condition to produce mixed amino acids，which can be used for gypsum retarder to realize safe utilization of WPM. Based on the single factor experiment，four factors were selected for orthogonal experiment：alkali concentration，solid-liquid ratio，treatment time，and temperature. The optimal conditions for the hydrolysis process were obtained：alkali concentration 0.04mol/L，solid-liquid ratio 1∶4，reaction time 10min，and at 85℃. Chemical composition of the product was analyzed using high speed amino acid analyzer. The retarding mechanism for desulphurization gypsum was investigated using FTIR and SEM. The results showed that the retarder contained amino acids such as lysine，tyrosine，and cysteine，etc. The amino and carboxyl group in the retarder chelated with calcium ion，forming mixed amino acids/small peptides complexes，which delayed dissolution，hydration and crystallization of gypsum crystals，thereby prolonging the setting time of gypsum paste.

mycelium residue；gypsum retarder；microwave；protein；hydrolysis；mixed amino acids；petptide

X705

A

1000–6613（2017）06–2275–07

10.16085/j.issn.1000-6613.2017.06.044

2016-10-09；

2017-02-09。

国家自然科学基金项目（21304030）。

张蒙蒙（1992—），女，硕士研究生。联系人：赵风清，博士，教授。E-mail：zhaofq3366@126.com。