胶原蛋白自组装生物功能材料的研究进展

王瑞瑞，王鸿儒



胶原蛋白自组装生物功能材料的研究进展

王瑞瑞1，2，王鸿儒1

（1陕西科技大学轻工科学与工程学院，中国轻工业皮革清洁生产重点实验室，陕西西安710021；2青海师范大学化学化工学院，青海西宁 810008 ）

胶原蛋白在体外自组装形成高度有序的网状结构，有利于细胞的黏附、增殖、扩散和迁移，具有良好的生物相容性、优异的力学性能、可生物降解性和弱抗原性。本文首先介绍和分析了胶原蛋白自组装功能材料的4种组装方法，即模板自组装法、原位自组装法、定向自组装法和诱导自组装法和分析的研究现状；比较了4种自组装方法的组装原理和组装特点；然后总结了胶原蛋白自组装生物功能材料作为组织替代材料，靶向给药材料，光、电、声特异传导功能材料在再生医学、基因治疗、药物设计、组织工程、医学影像等领域的应用现状和发展趋势；最后指出了胶原蛋白自组装生物功能材料今后的研究方向，表明胶原蛋白自组装生物功能材料在生物医学领域具有广阔的应用前景。

蛋白质；自组装；制备；功能材料；生物医学工程

胶原蛋白是构成细胞外基质、结缔组织、韧带、肌腱、皮肤、骨和软骨的重要组成部分，是哺乳动物体内主要的结构蛋白[1-2]。胶原蛋白具有由三条肽链组成的独特三股螺旋结构[3]，是一种天然一维纳米材料[4]。在机体内，胶原蛋白自发组装成有序的胶原纤维和胶原纤维束，进而形成宏观网络结构，胶原蛋白是许多生物组织的结构框架[5-7]，可赋予组织优异的生物力学性能和组织结构多样性[8]。

随着微纳米组装技术的快速发展，胶原蛋白在体外通过疏水相互作用[9]、静电相互作用[10-12]、化学交联反应[13]、半胱氨酸参与的化学反应[14-16]、金属-配体配位反应[17]、π-π堆积[18]和空间结构优势互补[19]等作用自组装形成高度有序的微观结构，制备的胶原蛋白自组装材料因具有优异的生物相容性、可生物降解性和弱抗原性，被认为是最有用的生物材料之一[20]。近年来，设计和合成具有优异性能的胶原蛋白自组装生物功能材料已成为研究热 点[21-24]。

1　胶原蛋白自组装生物功能材料

自组装生物功能材料使用的胶原蛋白来自两个方面：一是将来源于生物体的天然胶原蛋白作为构筑基元，构建多种多样超分子纳米结构；二是人工合成具有胶原蛋白次级结构和生物活性的胶原蛋白模拟肽，作为天然胶原蛋白的模型分子。胶原蛋白模拟肽是多个氨基酸序列的循环单元，可以根据需求人工合成任意长度的胶原蛋白模拟肽。用胶原蛋白模拟肽修饰构筑基元主体，最终达到组装目的。目前，胶原蛋白自组装生物功能材料的组装方法主要有模板自组装法、原位自组装法、定向自组装法和诱导自组装法等。

1.1模板自组装法

模板自组装法是将结构限制在模板表面，对自组装行为进行引导，促使空间相在较大范围结构有序。模板自组装法可以控制膜的层数制备单层膜、多层膜和复合膜，调控材料的功能特性。与其他自组装法相比，操作最简单，通用性最强，适用于各种类型的基材[25-26]。最常用的模板自组装法是层层（LBL）自组装法。层层自组装法将阴阳离子层交替沉积在基板上[27]，借助分子间的静电引力，自发构筑超分子结构[28]。

利用层层自组装技术，将胶原蛋白和其他具有特定功能的物质组装到材料表面，对材料进行修饰，胶原蛋白组装形成高度有序的结构，使材料获得良好的生物相容性，不会对机体产生免疫毒性。同时，特定功能的物质可赋予材料光、电、磁、力等新性能。XING等[29]在聚醚酰亚胺处理的载玻片上利用层层自组装法制备了纳米金-胶原蛋白/多肽修饰光敏剂（TPPAc-PLL）多层复合膜。如图1所示，纳米金结合胶原蛋白和多肽修饰光敏剂通过静电引力结合形成多层膜，操作方法简单。胶原蛋白使膜保持生物活性，高度有序的结构使膜具有优异的力学性能，为细胞的生长提供了良好的环境。将聚赖氨酸（PLL）与完全不溶于水的光敏剂5-[4-羧基苯基]-10,15,20-三苯基卟吩（TPPAc）偶联，改善了光敏剂TPPAc的水溶性，由于光敏剂TPPAc的存在，当受到光波照射时，靶向细胞中的组织蛋白酶使多聚赖氨酸链降解，阻断光敏分子的自淬灭反应，产生单线态氧，从而控制靶向细胞的凋亡（剥离），这种方法为调节细胞生长和细胞凋亡提供了有效的平台，可用于抗癌药物的设计和制备。

FAN等[30]利用层层自组装法在硅衬底上制备了均匀的胶原蛋白/磷酸八钙复合涂层。在典型的沉积条件下，薄的磷酸钙涂层（100nm）会在阴极硅表面形成第一层，其次是厚的、多孔复合涂层（约100μm），这种多孔复合涂层是富集了磷酸八钙盐晶体的胶原纤维网络结构。胶原蛋白使材料具有优异的生物相容性，在植入过程中不会产生免疫毒性。胶原蛋白/磷酸八钙类骨复合涂层有助于金属骨科植入物的骨生长和固定，这种方法不仅为生物活性植入物的制备提供了新方法，还可用于研究生物组织中胶原蛋白的生物矿化机制。GREGUREC等[31]进行了促进假体钛材料骨整合的研究，利用自组装的方法将海藻酸钠和胶原蛋白交替组装到氧化钛表面。胶原蛋白和海藻酸钠通过交联剂碳化二亚胺（EDC）实现化学交联，在氧化钛表面组装了结构稳定的生物活性涂层，由生物活性涂层包覆的氧化钛材料具有良好的生物相容性和力学性能。这种由化学交联反应和静电引力共同作用的自组装涂层结构更稳定，机械强度更高。HUANG等[32]以静电纺丝法制备聚己内酯（PCL）-乙酸纤维素（CA）模板，采用层层自组装法将带正电荷的壳聚糖（CS）和带负电荷的纳米Ⅰ型胶原蛋白交替组装到聚己内酯-乙酸纤维素模板上。胶原蛋白自组装成高度有序的多孔网状结构，使纳米纤维垫具有强的细胞粘附力，利于正常真皮成纤细胞的扩散。同时，通过调控壳聚糖/胶原蛋白双层膜的层数制备性能各异的(壳聚糖/胶原蛋白)（表示壳聚糖/胶原蛋白双层膜的数量）层层结构。制备的纳米纤维垫能够提高细胞的体外迁移能力，促进体内再上皮化和血管新生，具有快速修复受损皮肤结构的功能特性。这种方法可用于制造功能性医用敷料。

总之，利用模板自组装法使胶原蛋白在自组装过程中与其他功能物质发生协同作用，使材料获得高度有序的结构特征，从而获得理想的应用性能。

1.2原位自组装法

胶原蛋白原位自组装法主要利用化学交联反应在合成与组装微纳结构材料中巧妙的调控作用，得到多功能组装体。与其他自组装法不同，原位自组装法并不是通过次级作用力（静电引力、疏水作用等）形成网状结构，而是依靠分子链间的共价键形成高度有序的网状结构，这种组装结构更稳定、结构可控性更高、反应时间更短、成本更低。

BEAK等[33]利用原位组装法制备了胶原蛋白-聚丙烯酰胺互穿网络（IPN）聚合物水凝胶。如图2所示，在原位自组装过程中，胶原蛋白和聚丙烯酰胺两种不同的网络结构通过胶原蛋白分子中胺基和丙烯酰胺分子中的乙烯基之间的Michael加成反应形成互穿网络结构，提高了水凝胶的生物相容性、溶胀率和力学性能。结果表明，原位自组装法制备的胶原蛋白-聚丙烯酰胺互穿网络聚合物水凝胶的溶胀率与弹性模量之间没有相关性，水凝胶性能优异、结构可控、操作简单。

PUTTAWIBUL等[34]采用原位自组装法冻融杂交制备的水凝胶作为半月板组织工程支架，先采用冻融法制备高分子量的聚乙烯醇，然后与胶原蛋白混合，再冻融制备水凝胶。聚乙烯醇分子中的羟基与胶原蛋白分子中的羰基相互作用，聚乙烯醇和胶原蛋白杂化形成具有粗糙表面的多孔网络结构，制备的水凝胶保持了聚乙烯醇和胶原蛋白的生物特性，将原位自组装法和冻融法结合可以进一步提高水凝胶溶胀率、力学性能和回收利用率。GIRAO 等[35]用氧化石墨烯（GO）与胶原蛋白自组装制备多孔网状支架。氧化石墨烯纳米片边缘的含氧官能团与胶原蛋白分子肽链上的氨基相互作用形成多孔网状结构。胶原蛋白使新支架具有良好的生物相容性和稳定性，不会对机体产生免疫毒性。这种方法为制备生物活性支架提供了新思路。IMPARATO等[36]通过一种自下而上的组装方法制备了真皮等效组织支架，可以通过调节甘油醛和明胶（w=176654）的交联度控制支架的力学性能和降解率。这种方法制备的材料能够重现体内细胞和细胞外成分之间复杂的动态平衡，可作为专用体外疾病模型用于人体生理学的研究。

总之，胶原蛋白原位自组装法可以根据需求对组装体结构进行调控，提高材料的力学性能、延缓降解速率，并保持胶原蛋白的生物活性，消除材料的免疫毒性，这种方法广泛用于胶原蛋白水凝胶的制备。

1.3定向自组装法

定向自组装法是通过外形识别或自选性胶体等来实现微元件在相应基板上的定向和定位，进而完成微元件的组装。与其他自组装法相比，定向自组装法简单快捷，能形成单分散结构，并能组装成管状、螺旋状、球状、花朵状和碗状等多种结构，对组装结构的可控性最强。

SAN等[37]用自组装技术将胶原蛋白模拟肽（CMP结构见图3）通过外形识别定向结合到纳米金颗粒表面。如图3所示，两种纳米金粒子（10nm和20nm）易于吸附相反极性的胶原蛋白模拟肽，进而组装形成有序聚集体。人工合成的胶原蛋白模拟肽质量可控，结构明确。将胶原蛋白模拟肽吸附到纳米金颗粒表面，可以有效防止纳米金粒子的聚集和控制相邻胶原模拟肽之间的三螺旋折叠。合成的胶原蛋白模拟肽-纳米金材料对高度特异性的变性胶原蛋白具有靶向性，可以用于安全无害、选择性的去除蛋白试剂和药物中的明胶。这种方法可用于医用诊断材料的设计、制备。

CHOI等[38]采用旋涂定向自组装法将 (单宁酸/支化聚乙烯亚胺)/(二甲基二烯丙基氯化铵/木质素)多层膜和胶原蛋白相互作用制备多功能水凝胶。胶原蛋白和单宁酸（TA）通过氢键和疏水相互作用形成组装体。高度有序的结构使水凝胶机械强度更高、稳定性更好并具有优异的抗菌性能，可作为阿霉素等抗癌药物的缓释剂。这种方法被用于抗癌药物的设计。

总之，胶原蛋白定向自组装法通过定向识别、旋涂等手段调控组装结构，操作方法简单。但是，定向自组装法在操作过程中一定要合理控制组装速度，组装速度过快，会出现很多缺陷和裂缝；组装速度过慢，会出现分层结构。

1.4诱导自组装法

诱导自组装法是通过流体、电磁场等介质诱导形成高度有序的组装体，赋予组装体特定的功能。与其他自组装法相比，诱导组装法具有结构可调、过程可逆的特点，胶原蛋白在诱导自组装过程中不会引入其他有毒材料，避免自组装材料遭受污染，是目前最安全的组装方法。

JEREMY等[39]研究了胶原蛋白模拟肽（hbyp3、hbyp3-11；氨基酸序列见图4）分级组装过程。如图4所示，胶原蛋白模拟肽首先形成三股螺旋结构，然后进一步组装形成盘状结构，最后在金属离子如二价铁离子的促进下形成聚合物笼状结构-胶原蛋白肽笼，可用于药物的传递。高度有序的笼状结构在药物递送过程具有稳定性，由于组装过程可逆，到达靶向组织后通过改变环境条件达到药物释放的目的。这为设计合成新的刺激响应性功能材料提供了新方法。

GUO等[40]报道了一种简单的磁诱导技术生产胶原蛋白凝胶的方法。这种技术只需要胶原蛋白溶液、表面改性的磁珠、一块小磁铁和一个孵化器。因此，这是目前唯一不需要专门设备的胶原蛋白定向组装技术。链霉亲和素改性的磁珠诱导组装了结构高度有序的胶原蛋白凝胶。磁诱导方法允许用于细胞嵌入的凝胶构建，胶原-细胞层状结构有利于组织形成。此外，嵌入细胞有序排列的胶原蛋白凝胶允许细胞在各向同性和各向异性的环境中进行基质迁移和重塑。这种方法在组装过程中不添加任何化学试剂，可实现清洁化生产。KIM等[4]研究了碳纳米管（CNT）对胶原纤维结构、机械强度和组装动力学的独特影响。结果表明，碳纳米管与胶原蛋白在分子水平上相互作用。碳纳米管松散了胶原纤维的螺旋线圈，使胶原纤维的螺旋线圈扁平化，胶原纤维的D周期增长。同时，氧化碳纳米管的表面电荷增强了局部胶原蛋白自组装，形成较厚的胶原纤维网状结构，利于神经干细胞的分化，显著增加胶原纤维的机械强度，这种方法为制备生物医用材料提供了新思路。LUO等[41]研究了金属离子促进胶原蛋白模拟肽形成高度有序的组装体。胶原蛋白模拟肽[ CLP，氨基酸序列：HypGly(ProProGly)4(ProHypGly)(ProProGly)4GlyHyp(ProHypGly) ]能在Ni2+、Zn2+和Cu2+等二价金属离子诱导下进行组装。金属离子的盐桥作用辅助组装微纳结构可用于调控胶原蛋白模拟肽组装体的三股螺旋构象，形成高度有序的结构。这种方法为设计新型生物材料提供了方向。BORALDI等[42]报道了酶促矿化法制备矿物沉积和成纤细胞均匀分布的胶原蛋白凝胶。MgCl2对胶原蛋白的组装结构起关键作用，结合成纤细胞可制备出不同三维结构的矿化胶原蛋白基质，作为软结缔组织间质细胞原型，这种方法为研究异位钙化开辟了新的途径。

总之，诱导自组装法组装过程可逆，通过调控胶原蛋白自组装体结构使材料获得独特性能，这种方法环境友好，为设计、制备安全无毒的生物材料提供了方向。

2　胶原蛋白自组装生物功能材料的应用

胶原蛋白自组装功能材料具有高度有序的结构特征，为新材料的应用提供了无限的可能。胶原蛋白自组装材料在靶向给药、生长因子缓释、基因疗法、医学影像和组织工程中具有广阔的应用 前景。

2.1具有负载功能的组织替代材料

组织替代材料必须具有高的机械强度才能支撑和保护细胞的黏附、增殖、扩散和迁移。否则，使用过程中易发生塌陷，影响使用寿命。胶原蛋白自组装的膜、支架、凝胶等材料具有机械强度高、生物相容性好、生物活性高等优点，是理想的组织替代材料。目前，具有负载功能的组织替代材料包括硬组织替代材料和软组织替代材料。胶原蛋白自组装材料作为硬组织替代材料主要用于人造骨骼、人造关节和人造牙齿等。假体钛等金属材料虽然有高的机械强度，但是不利于细胞的生长，将胶原蛋白自组装在假体钛等硬组织植入物的表面，能显著提高成骨细胞的繁殖率[31，43]。通常，将胶原蛋白自组装在传统硬组织植入物的表面，形成高度有序的组装结构，利于细胞生长，新材料具有高的机械强度、优异的生物相容性，而且保持了胶原蛋白优异的生物活性，避免了细胞毒性反应。此外，矿化的胶原蛋白凝胶可以模仿骨的构成，已被广泛应用于骨组织工程[44]。SUPAPOM等[45]利用胶原蛋白自组装法制备胶原蛋白/丝素/壳聚糖复合支架，胶原蛋白自组装成高度有序的多孔结构，具有高强度、耐降解、高细胞存活率的特点，可作为骨缺损的支架材料。胶原蛋白自组装材料作为软组织替代材料主要用于人工瓣膜、人造血管、人造皮肤等。胶原蛋白自组装成高度有序的三维多孔网络结构，具有高的比表面积和高的孔隙度，能将多余的分泌液吸收，透气性强，能有效控制血液或体液流动，对生长因子具有瞬间封存的能力，利于细胞的生长[46]。研究表明与干细胞特异性抗体共价结合的胶原支架能有效促进心肌组织的再生[47]。例如，YOON 等[48]制备的胶原海绵，保持了胶原蛋白的生物活性，具有促进皮肤组织再生的潜力，适用于皮肤全层缺损的手术替代物。ARAVAMUDHAN等[49]将胶原蛋白自组装在天然聚合物[乙酸纤维素和聚(乳酸-乙醇酸)]微孔结构上。高度有序的多孔组装结构可以提高干细胞的诱导能力与亲水性天然高分子材料的生物相容性，作为软组织替代物。

总之，利用胶原蛋白自组装技术研发患病或受损器官和组织的高性能有效替代材料仍然是组织工程的研究热点。

2.2靶向给药材料

目前，药物的靶向递送是微纳结构技术发展的最前沿。通过微纳结构粒子递送药物的目的是减少对健康组织的间接损伤，延长该药在指定位置的时效性，最后希望这些颗粒在完成任务以后能自然降解，药物被加载在这些粒子上不会带来任何潜在的系统性副作用[50]。常用的靶向给药材料有纳米金、聚苯乙烯等，这类材料不具有理想的生物相容性和生物降解性。也有研究使用石墨烯、碳纳米管等碳材料，这类碳材料在使用过程中是否会对机体造成潜在伤害，目前仍存在很大争议。然而，胶原蛋白自组装材料抗菌性能好、机械强度高、生物相容性好，使用安全、无毒，是用于靶向给药的理想材料。胶原蛋白自组装材料用于靶向给药的制备思路是：①采用模板自组装法将胶原蛋白涂覆在相应的模板上，进而自组装成高度有序的结构，然后通过模板塌陷形成空穴，用以药物的靶向递送，通过控制膜的厚度实现药物的缓释。OMORPHOS等[51]采用层层自组装法制备的胶原蛋白微粒可用于基因、药物或生长因子等的靶向性递送和癌症的治疗，这种微粒利于正常细胞的生长。②采用原位自组装法和诱导自组装法制备环境响应性胶原蛋白水凝胶[33]，在溶液状态下包载药物，注射到机体后再形成高度有序的结构，到达目标组织后实现药物的控释。③采用人工设计合成胶原蛋白肽，用诱导自组装法制备胶原蛋白肽笼[39]，实现药物的靶向递送，到达目标组织后，再利用可逆组装，对药物进行可控缓释。

总之，胶原蛋白自组装体具有利于细胞、组织生长的结构，又有优异的生物活性和低细胞毒性，是理想的靶向给药材料。

2.3光、电、声特异传导功能材料

利用胶原蛋白自组装技术使生物材料具有高度有序、图案化的微纳结构，能够优化微小型传感器、生物载体和微型光学元件等的性能、响应速度、成本和能耗。目前，胶原蛋白自组装材料用于制作生物传感器、心脏起博器、人工晶状体等。在胶原蛋白自组装过程中引入镧系离子、钆离子、铁离子等多种金属离子，通过对基材的修饰，形成高度有序的构造单元，使材料获得光、电、磁、力等独特性能，同时使材料保持生物活性，将成为胶原蛋白自组装领域的研究热点。例如，可以在胶原蛋白自组装过程中将镧系离子（Ln3+）引入辅助组装，形成功能材料。这种材料不仅具有天然胶原蛋白周期性带状特征，而且由镧系离子介导的自组装是完全可逆的，从而使材料具有优异的发光特性。这种方法制备的发光纳米材料在细胞成像、医学诊断和荧光支架细胞培养等方面具有较大的应用潜力[52]。

总之，利用胶原蛋白自组装技术使新材料实现结构有序化、图案化，制作方法简便、结构多样、重复性好、经济可行。新材料在生物医学领域具有良好的应用前景。今后，利用胶原蛋白自组装技术设计制造特异传导功能材料的研究将成为发展 趋势。

3　结语及展望

胶原蛋白自组装生物功能材料具有优良的生物相容性、可生物降解性和弱抗原性，在生物医学领域具有广阔的应用前景。目前，已经有关于胶原蛋白自组装机制的研究报道[53]。但是，由于胶原蛋白分子本身的结构复杂性，因此对于胶原蛋白自组装体的组装机制尚未明确。而且，不同来源、不同大小的胶原蛋白分子对生物功能材料组装过程和性能影响的比较研究还尚未见报道。今后的研究将集中于下列几个方面。

（1）继续开发具有独特性能的新型胶原蛋白自组装功能材料，进一步拓宽应用领域。

（2）探究不同来源、不同分子量的胶原蛋白对材料组装过程和性能的影响，为进一步实现胶原蛋白的可控组装提供参考。

（3）设计有效的测试手段，进一步明确胶原蛋白自组装体的组装机制，用以控制组装体的形貌和尺寸。

（4）继续从动力学和热力学的角度研究胶原蛋白自组装体系的组装行为，为设计新的胶原蛋白自组装材料提供理论指导。

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Progress of research on collagen self-assembly biological functional materials

WANG Ruirui1，2，WANG Hongru1

（1Key Laboratory of Leather Cleaner Production，China National Light Industry，College of Bioresources Chemical and Materials Engineering，Shaanxi University of Science & Technology，Xi’an 710021，Shaanxi，China；2College of Chemistry and Chemical Engineering，Qinghai Normal University，Xining 810008，Qinghai，China）

Collagen self-assembled into highly orderednetwork structure，which helps to cell adhesion，proliferation，spreading，and migration. Collagen self-assembly biological functional materials have highly ordered structure characteristics，excellent mechanical properties，good biocompatibility，biodegradability，and low immunogenic idiosyncrasy. The assembly process of the four self-assembly technologies，which are template self-assembly technology，self-assembly technology，directed self-assembly technology and induced self-assembly technology，is described. The status of research on those four self-assembly technologies is presented. The theory and characteristic of four self-assembly technologies is discussed. Then，the application of collagen self-assembly biological function materials as tissue replacement material，targeted drug delivery material，functional material of specific conduction of light，electricity，sound，is summarized. The development trend of collagen self-assembly biological function materials in regenerative medicine，gene therapy，drug design，tissue engineering，medical imaging，etc，is identified. Finally，the direction of future development of collagen self-assembly biological function material is proposed. Results show that the collagen self-assembly biological functional materials have broad application prospects in biomedical field.

protein；self-assembly；preparation；functional materials；biomedical engineering

TQ93

A

1000–6613（2017）06–2215–07

10.16085/j.issn.1000-6613.2017.06.034

2016-11-04；

2016-11-21。

王瑞瑞（1980—），女，博士研究生，副教授。E-mail：wangruirui206@163.com。联系人：王鸿儒，博士，教授。E-mail：wanghru@tom.com。