紫杉醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠CD28、CTLA-4表达及BAFF的影响

张淑江，李作孝

(西南医科大学附属医院神经内科，四川 泸州 646000)

研究报告

紫杉醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠CD28、CTLA-4表达及BAFF的影响

张淑江，李作孝*

(西南医科大学附属医院神经内科，四川 泸州 646000)

目的 探讨紫杉醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmunencephalomyelitis，EAE)大鼠脑组织中CD28、CTLA-4表达及脾组织上清液中B细胞刺激因子(BAFF)含量及其意义。方法 按随机数字法将50只Wistar大鼠分为5组：紫杉醇(PTX)小、中、大3个剂量组(PTX剂量分别为1 mg/kg，2 mg/kg，4 mg/kg)、正常对照组，EAE对照组,每组10只。用豚鼠脊髓制成GPSCH并与CFA等体积混合制成免疫抗原，注入大鼠双足侧足垫(2 mL/kg)进行EAE造模，自造模后，PTX各剂量组腹腔注射紫杉醇，连续10 d。正常对照组及EAE对照组均给予腹腔注射0.9%NaCl 2 mL。采用脑组织学评分评估实验大鼠脑组织炎症浸润情况，取大鼠脑组织采用流式细胞仪测定脑组织CD28、CTLA-4含量，取脾组织并制成上清液，采用ELISA测定脾组织中BAFF含量。结果 PTX各剂量组脑组织评分均低于EAE对照组，各组间差异有显著性(P< 0.01)；PTX各剂量组大鼠脑组织中CD28表达均低于EAE对照组，各组间差异有显著性(P< 0.01)；CTLA-4表达均高于EAE对照组，各组间差异有显著性(P< 0.01)；脾组织上清液中BAFF含量均低于EAE对照组，各组间差异有显著性(P< 0.01)。结论 PTX可降低EAE大鼠神经功能障碍评分，其机制可能涉及调节大鼠脑组织中CD28、CTLA-4的表达及脾组织上清液中BAFF含量，从而发挥对EAE的防治作用。

紫杉醇；实验性自身免疫性脑脊髓炎；CD28；CTLA-4；B细胞刺激因子

实验性自身免疫性脑脊髓炎是多发性硬化(multipie sclerosis，MS)的理想动物模型，临床上使用的药物对MS都疗效欠佳，且不能发挥防治作用，故探讨新的治疗药物显得尤其必要，紫杉醇(Paclitaxel，PTX)在临床上用于各种恶性肿瘤的化疗，且价格低廉。其作用机制可能与调节免疫细胞含量及相关细胞因子含量有关，而MS属于自身免疫性疾病，免疫系统功能的紊乱在此病的发生发展过程中发挥重要作用[1]，国外已有数位学者将PTX用于EAE大鼠的研究。比如Frequin等[2]研究发现PTX通过其抗炎及免疫调节功能对EAE大鼠发挥着防治作用，其可降低EAE大鼠的发病率，延长EAE大鼠发病的潜伏期，缩短EAE大鼠疾病的进展期，改善EAE大鼠临床症状，降低神经功能障碍评分。本试验采用wistar大鼠建立EAE模型，应用不同剂量的PTX进行干预，观察PTX对大鼠发病情况脑组织病理改变的影响，并测定脑组织中CD28、CTLA-4表达水平及脾组织上清液中B细胞刺激因子含量(B lymphocyte stimulator, BAFF)，从而探讨其对EAE及MS的防治作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雌性Wistar大鼠50只,6周龄，体重(210～230) g，成年8周龄雌性豚鼠5只，体重(350～400)g,所有动物均为清洁级，均购自四川大学华西实验动物中心[SCXK(川)2013-026]，实验均在西南医科大学中心实验室完成[SYXK(川)2013-185]。将Wistar大鼠及豚鼠分开饲养(普通环境)，保持饲养条件恒温、恒湿，定时定量给予饲料、水，并定期更换垫料，保持生存环境清洁，1周后观察大鼠及豚鼠活动情况，死亡及活动度差的大鼠予以剔除，并及时补足同等数量大鼠及豚鼠。

1.2 主要试剂和药物

紫杉醇注射液(哈药集团生物工程有限公司，5 mL/支),CFA(美国Chondrex公司);BCG冻干粉：每支60 mg (上海生物制品研究所),PE标记的小鼠抗大鼠CD28和CD152抗体及相应荧光素标记的小鼠IgG1抗体(美国Caltag实验室), BAFF酶联免疫吸附法试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)，PBS缓冲液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；淋巴细胞分离液，称量瓶、显微镜、一次性流式管、显微镜、流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)等。

1.3 实验方法

1.3.1 抗原制作及动物模型建立

参照Hoehlig K等[3]制作EAE模型的方法进行造模，用豚鼠脊髓制成GPSCH并与CFA等体积混合制成免疫抗原，注入大鼠双足侧足垫(2 mL/kg)进行EAE造模；正常对照组大鼠于相同部位注射等量CFA，所有动物均在同等条件下饲养。

1.3.2 实验动物的分组及干预处理

将50只Wistar大鼠随机分为5组：PTX小、中、大剂量组,正常对照组,EAE对照组,PTX小、中、大剂量组腹腔注射PTX剂量分别为1 mg/kg，2 mg/kg，4 mg/kg，连续10 d。正常对照组及EAE对照组均给予腹腔注射0.9% NS 2 mL，所有动物均在同等条件下饲养，均在1月后抽取血清，处死并取脑组织。

1.3.3 脑组织学评分

脑组织学评分标准如下[4]：0分，无炎症改变；1分，浸润的炎性细胞限于血管周和脑脊膜周围；2分，炎性细胞脑实质内轻度浸润，1～20个/片；3分，炎性细胞脑实质内中等程度浸润，21～100个/片；4分，脑实质内浸润的炎细胞达100个/片以上。每张切片随机选取5个视野计数后取均值，每只大鼠取2张切片作计数，将2张切片计数后的平均值作为该只大鼠的评分结果。

1.3.4 脑组织CD28、CTLA-4测定

用PBS缓冲液去除大鼠的延髓组织血迹，使用研磨器将延髓组织制成匀浆，以3000 r/min离心15 min后取上清液，采用流式细胞仪测定脑组织CD28、CTLA-4含量。

1.3.5 脾组织上清液BAFF含量测定

无菌取出脾脏后，剪碎脾组织，并用玻璃注射器针芯进行研磨，后用无菌生理盐水进行冲洗，经铜网进行过滤以除去结缔组织被膜，然后将脾细胞悬液收集于无菌细胞培养皿内，取与脾细胞悬液等体积的淋巴细胞分离液加入至离心管，将脾细胞悬液慢加入至淋巴细胞分离液上；室温300 g离心20 min，吸取单个核细胞层，转入至新的离心管中，加入缓冲液，300 g离心10 min，弃上清后，再洗涤一次；弃上清，用细胞培养液重悬，台盼蓝染色计数活细胞率大于95%，调整细胞浓度为1×106/mL。采用ELISA法测定BAFF含量,具体操作步骤按试剂盒说明操作。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 模型大鼠的表现及相关评分

EAE大鼠造模成功表现：早期表现为活动及进食量减少、精神萎靡、反应迟钝、体重下降，后期出现抬尾无力、后肢无力，严重者表现为尾巴及四肢瘫痪拖地，后肢双足跖面向上，抬头无力。

EAE对照组评分最高，PTX各剂量组评分均较EAE对照组评分下降，差异有显著性(P < 0.05)，且EAE大鼠脑组织病理学评分随PTX剂量增加而依次降低，各剂量组间差异有显著性(P < 0.05)。(见表1)

2.2 脑组织中CD28、CTLA-4含量变化

EAE对照组CD28含量较正常对照组高，CTLA-4含量较正常对照组低，差异有显著性(P < 0.01)，PTX各剂量组脑组织CD28含量皆较EAE对照组降低，差异有显著性(P < 0.01)；脑组织CD28含量随PTX剂量增加而明显降低，各组间差异有显著性(P < 0.01)。PTX各剂量组脑组织CTLA-4含量均较EAE对照组升高，差异有显著性(P < 0.01)；脑组织CTLA-4含量随PTX剂量增加而明显增加，PTX大、小剂量组差异有显著性(P< 0.01)，PTX大与中剂量组、中与小剂量组差异无显著性(P> 0.05)。(见表2)

Tab.1 The scores of pathological chages in the brain of all the groups

组别Groups脑组织学评分Braintissuescore正常对照组Normalgroup0EAE对照组Modelgroup2.67±0.52PTX小剂量组Smalldosegroup1.61±0.24aPTX中剂量组Middledosegroup1.44±0.22abPTX大剂量组Highdosegroup1.23±0.31abc

注：与EAE对照组相比，aP< 0.05；与PTX小剂量组相比，bP< 0.05；与PTX中剂量组相比，cP< 0.05。

Note.The doses of small,middle,high group were 1 mg/kg,2 mg/kg,4 mg/kg;Compared with model group,aP< 0.05;compared with small dose group,bP< 0.05;compared with middle dose group,cP< 0.05.

Tab.2 The levels of CD28 and CTLA-4 in the brain of all the groups

组别GroupsCD28CTLA-4正常对照组Normalgroup15.3±3.779.7±2.16EAE对照组Modelgroup41.2±4.09a3.6±1.32aPTX小剂量组Smalldosegroup33.9±4.49ab4.3±1.42abPTX中剂量组Middledosegroup26.4±4.14abc5.8±1.81abPTX大剂量组Highdosegroup20.7±4.21abcd6.4±1.68abc

注：与正常对照组相比，aP< 0.01；与EAE对照组相比，b1P< 0.05、b2P< 0.01；与PTX小剂量组相比，cP< 0.01；与PTX中剂量组相比，dP< 0.01。

Note. Compared with normal group,aP< 0.01;compared with model group,b1P< 0.05、b2P< 0.01;compared with small dose group,cP< 0.01;compared with middle dose group,dP< 0.01.

2.3 各实验组大鼠脾组织上清液BAFF含量测定结果

与正常对照组相比，EAE对照组及PTX各剂量组脾组织上清液中BAFF含量均增加(P< 0.01)。与EAE对照组比较，PTX各剂量组脾组织上清液中BAFF含量均减少(P< 0.01或P< 0.05)。随着PTX剂量的增加，BAFF含量依次减少，各组间差异有显著性(P< 0.01)。(见表3)

Tab.3ThelevelsofBAFFinthesplenictissuefluidofallthegroups

组别GroupsBAFF/pg/mL正常对照组Normalgroup50.2±6.42EAE对照组Modelgroup110.3±10.29aPTX小剂量组Smalldosegroup101.5±6.49ab1PTX中剂量组Middledosegroup87.1±7.88ab2cPTX大剂量组Highdosegroup62.7±6.11ab2cd

注：与正常对照组相比，aP< 0.01；与EAE对照组相比，b1P< 0.05、b2P< 0.01；与PTX小剂量组相比，cP< 0.01；与PTX中剂量组相比，dP< 0.01。

Note.Compared with normal group,aP< 0.01;compared with model group,b1P< 0.05、b2P< 0.01;compared with small dose group,cP< 0.01;compared with middle dose group,dP< 0.01.

3 讨论

CD28或CTLA-4/B7协同刺激分子在EAE中起重要的作用。CD28及CTLA-4(又称CDl52)均是参与T细胞识别抗原与活化的重要CD分子，CD28与CTLA-4在T细胞上表达的多少与免疫反应密切相关。研究已证实，给予EAE大鼠CD28抗体治疗可以特异性地阻断Th介导的B细胞分泌免疫球蛋白(Ig)过程[5,6]，特别是EAE大鼠发病开始时，从而阻断疾病的进展。CTLA-4可产生负向调节信号和抑制细胞周期的进程，涉及的主要机制为抑制TCR和CD28介导IL-2产生[7]，导致免疫反应的终止。CTLA-4与CD28具有相反的免疫作用，给予抗CTLA-4抗体可加重EAE大鼠发病症状或导致其复发[8]。CTLA-4还可阻止缓解复发型的EAE的进程。以上研究均表明CD28或CTLA-4/B7协同刺激分子在EAE中发挥重要的作用。

BAFF是1998年发现的肿瘤坏死因子家族的新成员，主要由单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞合成、中性粒细胞产生。已有研究证实，在有些MS病人T细胞或者单核细胞分泌的BAFF含量增加[8]。对BAFF受体缺乏的大鼠及未缺乏大鼠同时给予抗原建立EAE模型，BAFF受体缺乏的大鼠临床症状提前，且较未缺乏的大鼠临床症状重、神经功能障碍评分更高，发病潜伏期较对照组短，脑脊髓的炎症范围更大，中枢神经系统内BAFF含量较对照组增加，中枢神经系统浸润的炎症细胞更多，而外周的促炎性细胞因子的数量增多。在狨猴的EAE模型实验中，不管是在造模前还是造模后使用抗BAFF的抗体均有助于减少外周血、脾组织淋巴器官中CD20+B细胞数量、抑制Ig的产生,还能抑制T细胞活化，减少CD4+T细胞数量。在造模前使用抗BAFF的抗体能显著降低EAE的发病率。使用抗BAFF抗体的狨猴症状出现时间较未使用抗BAFF抗体的EAE对照组迟，神经功能障碍评分、脊髓炎症浸润程度及髓鞘脱失程度较对照组低，进展较对照组慢。使用抗BAFF的抗体的狨猴外周血单个核细胞、脾组织及外周淋巴结IL-17含量较对照组低，而IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6含量减少，TGF-β含量增加，对EAE狨猴继续使用抗BAFF的抗体还能使已经出现的症状具有改善作用[9,10]。

PTX因其良好的抗肿瘤作用广泛应用于临床，新近的研究表明，PTX除了具有抗肿瘤作用外还具有广泛的免疫调节作用，新近的研究表明PTX能调节肿瘤宿主体内调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)的数量，具有免疫调节作用。在PTX治疗乳腺癌的研究中就发现，PTX能下调内皮细胞间粘附分子-1的表达，而ICAM-1具有保护血脑屏障受损、减少巨噬细胞进入血脑屏障的作用[11,12]，其还能刺激T淋巴细胞活化的能力、使IL-2、INF-等细胞因子分泌减少，而IL-2、INF-已被证实，是具有加重EAE病情的细胞因子[13]。PTX还可使CD3+T细胞的杀伤活性降低，发挥其免疫抑制作用。

因此我们认为PTX可能通过诱导淋巴细胞凋亡及抑制淋巴细胞分裂使免疫活性细胞处于高凋亡低增值状态，从而抑制机体的免疫功能。以上研究证实，PTX具有广泛的免疫调节作用,而MS的主要发病机制就是免疫功能紊乱导致的，PTX通过其免疫调节作用可能对治疗MS有效。基于以上假设，并查阅了相关文献发现，国外已有研究者将PTX用于EAE大鼠模型，发现PTX通过其抗炎及免疫调节功能对EAE大鼠发挥着防治作用，而且PTX还能抑制骨髓未成熟B细胞向外周淋巴器官迁移，减轻MS患者的炎症反应。

本实验结果亦证实，PTX对CD28、CTLA-4、BAFF均具有调节作用，与EAE对照组比较，PTX各剂量组能降低脑组织内CD28、脾组织上清液中BAFF含量，升高脑组织中CTLA-4含量，结合大鼠脑组织学评分结果，可推断PTX可能对EAE具有防治作用。

但本实验仍具有不足之处，本实验研究在EAE大鼠疾病高峰期即处死发病大鼠测定以上细胞因子，故无法动态观察CD28、CTLA-4、BAFF等细胞因子的动态改变；因经费原因只测定了CD28、CTLA-4、BAFF含量，未检测更多免疫细胞及细胞因子含量，未能很好的阐述紫杉醇对EAE大鼠免疫网络的影响，且仍有实验涉及动物数量较少等局限性存在，仍需后续的研究完善有关机制的阐述。

[1] 杨元，袁正洲，吕志宇，等.血管活性肠肽(VIP)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠脑组织 IL-17A含量的影响[J].中国比较医学杂志，2016,26(10)：32-35.

[2] Frequin ST,Lamers KJ,Borm GF,etal.T-eell subsets in the cerebrospinal fluid and peripheral blood of multiple sclerosis patients treated with high-dose intravenous methylpredisdone[J].Acta Neurol Scand,1993,88(2):80-86．

[3] Hoehlig K,Shen P,Lampropoulou V,etal. Activation of CD4+Foxp+regulatory T cells proceeds normally in the absence of B cells during EAE[J].Eur J Immunol,2012,42(5):1164-1173.

[4] Yin JX,Tu JL,Lin HJ,etal.Centrally administered pertussis toxin inhibits microglia migration to the spinal cord and prevents dissemination of disease in an EAE mouse model[J].PLoS One, 2010,5(8):e12400.

[5] Perrin PJ,June CH,Maldonado JH,etal.Blockade of CD28 during in vitro activation of encephalitogenic T cells or after disease onset ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,1999,163(3):1704-1710.[6] McHugh RS,Ratnoff WD,Gilmartin R,etal.Detection of a soluble form of B7-1(CD80) in synovial fluid from patients with arthritis using monoclonal antibodies against distant epitopes of human B7-1[J].Clin Immunol Immunopathol,1998,87(1):50-59.

[7] Krummel MF,A11ison JP.CTLA-4 engagement inhibits IL-2 accumulation and cell cycle progression upon activation of resting T cells[J].J Exp Med，1996,183(6):2533-2540.

[8] Zhou X,Xia Z,Lan Q,etal.BAFF promotes Th17 cells and aggravates experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Plos one,2011,6(8): e23629.

[9] Jagessar SA,Heijmans N,Oh L,etal.Antibodies against human BLyS and APRIL attenuate EAE development in marmoset monkeys [J]. J Neuroimmune Pharmacol, 2012,7(3): 557-570.

[10] Huntington ND,Tomioka R,Clavarino C,etal.A BAFF antagonist suppresses experimental autoimmune encephalomyelitis by targeting cell-mediated and humoral immune responses [J]. Int Immunol,2006,18(10):1473-1485.

[11] 杨兆华,洪涛,王春生,等.紫杉醇对大鼠心脏移植物急性排斥反应的免疫抑制作用[J].中国胸心血管外科临床杂志,2006,13(6): 401-404.

[12] Stefan T,Marcus N,Scherer S,etal.The antineoplastic drug paclitaxel has immunosuppressive properties that call effectively promote all ograft survival in a rat heart transplant model[J].Transplantation,2002,73(2):216-223.

[13] Millán J, Hewlett L, Glyn M,etal. Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola-andF-actin-richdomains[J]. Nat Cell Biol, 2006,8(2):113-123.

The effects of paclitaxel on the levels of CD28,CTLA-4 and BAFF in experimental autoimmune encephalomyelitis

ZHANG Shu-jiang,LI Zuo-xiao*

(Department of Neurology,Affiliated Hospital of southwest Medical university,Luzhou 646000,China)

Objective To discuss the effects of Paclitaxel(PTX) on levels of CD28 and CTLA-4,B lymphocyte stimulator(BAFF) in experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE).Methods The 50 rats were divided into 5 groups by the random number table, 10 rats in each group,the doses of small group,Middle group, High group were 1 mg/kg，2 mg/kg，4 mg/kg by intraperitoneal injection for 10 consecutive days, the normal group and model group were injected 0.9% NS 2 mL,Using brain tissue score to estimate the neurological dysfunctions of rats.Using flow cytometry to detect the levels of CD28 and CTLA-4，using enzyme-linked immunosorbent (ELISA) to detect the levels of BAFF.Results The brain tissue score in PTX experimental groups were lower than model group,the comparative differences between groups were statistically significant(P< 0.01);The levels of CD28 in PTX groups were lower than EAE group，the comparative differences between groups were statistically significant(P< 0.01). The levels of CTLA-4 in PTX groups were higher than EAE group,the comparative differences between groups were statistically significant(P< 0.01);the content of BAFF in all PTX groups were lower than EAE control group.Conclusions PTX could decrease the brain tissue score,the mechanism may adjust the express of CD28、CTLA-4 in brain and the expression of BAFF.PTX may have preventive and therapeutic effects on EAE rats.

Paclitaxel;Exexperimental autoimmune encephalomyelitis;CD28;CTLA-4;B lymphocyte stimulator

泸州市科技创新苗子项目(2016-R-70 20/24)；西南医科大学附属医院院级课题。

张淑江(1989-)，女，医师，硕士生，研究方向：神经免疫。E-mail:939749262@qq.com

李作孝(1964-)，男，主任医师，硕士生，研究方向：神经免疫。E-mail:lzx3235@sina.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0071-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.016

2016-06-27