中国荷斯坦奶牛FASN基因部分序列多态性分析

任卫合，王丽萍，刘容秀，张 丽

（西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030）

研究简报

中国荷斯坦奶牛FASN基因部分序列多态性分析

任卫合，王丽萍，刘容秀，张 丽

（西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030）

利用PCR-SSCP技术，对中国荷斯坦奶牛脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）基因第34外显子进行多态性分析。结果显示：该区域存在A、B两种等位基因和AA、BB、AB三种基因型，其中等位基因A和B的频率分别为0.890 8和0.109 2，基因型AA、BB和AB的频率分别为0.908 0、0.011 5和0.195 4。A为优势等位基因，AA为优势基因型。群体遗传学分析发现，荷斯坦奶牛FASN基因的有效等位基因数（Ne）、遗传杂合度（He）、遗传纯合度（Ho）和多态信息含量（PIC）分别为0.184 5、0.195 7、0.804 3和0.175 6。卡方检验表明，该群体已经极显著地偏离了Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.01）。说明中国荷斯坦奶牛FASN基因exon34区存在遗传多态性。

FASN基因；基因多态性；PCR-SSCP；中国荷斯坦奶牛

脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）是由FASN基因编码的一种基本代谢酶类，对控制动物体脂沉积和乳脂脂肪酸合成代谢具有重要意义［1］。该酶主要表达在哺乳动物的肝脏和脂肪组织中［2-3］，负责催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成一种长链饱和软脂酸［4］。研究发现，脂肪酸合成酶直接受FASN基因表达情况的影响，若FASN基因的碱基序列发生突变，牛全乳中的脂肪酸含量就可能发生变化，对牛的泌乳性能产生影响［5］。Roy等［6］将牛FASN基因定位于19号染色体上，发现其包含42个外显子，编码2 513个氨基酸残基，且含有多个SNPs。研究表明，FASN基因缺失的小鼠胚胎会在其胚胎发育早期死亡，FASN基因突变的小鼠则会在其发育的不同时期死亡，表明脂肪酸合成酶对胚胎发育也有重要作用［7］。褚敏等［8］研究推测，FASN基因不仅影响牛肉脂肪酸的组成及含量，亦对牦牛肉的脂肪量及食用品质有影响，可作为牦牛肉质性状标记辅助选择的有效分析标记。

目前国内对荷斯坦奶牛FASN基因的研究还很少，本研究利用PCR-SSCP技术研究中国荷斯坦奶牛FASN基因第34外显子多态性，旨在丰富荷斯坦奶牛FASN基因库，并为泌乳基因、胚胎发育基因和肉质性状基因的筛选提供分子理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集及基因组DNA提取

血样采自宁夏贺兰山奶业有限公司的87头中国荷斯坦奶牛，用医用采血管静脉采血，每头10 mL，-20℃保存。采用苯酚-氯仿抽提法从备用冷冻血样中提取总基因组DNA，去离子水溶解稀释，-20℃保存备用。

1.2 引物设计与PCR扩增

根据GenBank中牛FASN基因的mRNA序列（登录号AF285607）设计1对特异性引物，用于扩增荷斯坦奶牛FASN基因序列。引物序列Forward：5′-CCAGACCTTAATTTGCCAATCCTC-3′，Reverse：3′CCCTCTAAAGCCGTCCTCACCA-5′，引物由大连宝生物公司合成，扩增区域从15 906 bp开始，包括了FASN基因外显子34的全部序列，目的片段216 bp。

以提取的DNA为模板，PCR扩增FASN基因。PCR扩增总反应体系为20 μL，其中模板DNA 0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，Taq PCR MasterMix 11 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，54℃退火30s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后置于4℃冷藏保存，以备SSCP分析。

1.3 SSCP检测与等位基因序列的回收测定

取3.0 μL的PCR产物与7.0 μL变性上样缓冲液（0.025%溴酚蓝、98%去离子甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.025%二甲苯氰）混合，98℃变性10 min后再立即冰浴10 min。将变性后的PCR产物点样至12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上（Acr∶Scr=29∶1），160V电压室温电泳4h。银染法显带，并确定其基因型。PCR产物经过SSCP确定基因型后，纯合子PCR产物用试剂盒回收后直接送北京华大公司测序。而杂合子个体参照Hu等［9］介绍的方法进行处理。

1.4 统计分析

利用Popgene32软件计算出FASN基因不同突变位点的等位基因频率、基因型频率、有效等位基因数（Ne）、遗传杂合度（He）、遗传纯合度（Ho）和多态信息含量（PIC），并对该群体进行Hardy-Weinberg平衡检验。

2 结果与分析

2.1 荷斯坦奶牛FASN基因PCR扩增结果

对303头荷斯坦奶牛的DNA样品PCR扩增后，经1%琼脂糖凝胶（100 V，30 min）电泳检测后均得到一条如图1所示的特异性好、条带清晰、长度约为216 bp的产物，与预期的目的片段大小一致，可用于SSCP检测。

图1 荷斯坦奶牛FASN基因exon34区域PCR扩增结果

2.2 PCR-SSCP检测及序列测定结果

中国荷斯坦奶牛FASN基因exon34序列区域共检测到A和B两种等位基因，共形成AA、BB、AB三种基因型（图2），其中等位基因A和B均具纯合型个体。

图2 荷斯坦奶牛FASN基因exon34区域SSCP检测结果

2.3 遗传参数分析

荷斯坦奶牛FASN基因exon34区基因频率、基因型频率以及各遗传多态性指标见表1和表2。等位基因A和B的频率分别为0.890 8和0.109 2，AA、BB和AB基因型频率分别为0.908 0、0.195 4和0.011 5。本研究中，荷斯坦奶牛FASN基因的有效等位基因数（Ne）、遗传杂合度（He）、遗传纯合度（Ho）和多态信息含量（PIC）分别为0.1845、0.1957、0.8043和0.1756。PIC值小于0.25，属于低度多态，说明该位点较为保守。卡方检验表明该群体已经极显著地偏离了Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.01）。

表1 荷斯坦奶牛FASN基因exon34区基因频率和基因型频率

表2 遗传多态性分析

3 讨论

近年来，国内外有关FASN基因的多态性报道相对较少。Abe等［10］在日本黑牛FASN基因编码区发现8个SNPs。Chirala等［7］在牛FASN基因中检测到了5个多态位点。褚敏等［8］在甘南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛FASN基因的第3内含子检测到1个多态位点。欧阳建华等［11］在鸡FASN基因最后1个内含子发现2个多态位点。Abiel［12］在西农萨能奶山羊的FASN基因中检测到3个多态位点。

本研究通过对荷斯坦牛FASN基因exon34区进行PCR－SSCP分析，结果发现A、B两个等位基因，其基因频率分别为0.890 8、0.109 2，A为优势基因，试验群体已经极显著地偏离了Hardy－Weinberg平衡状态（P＜0.01），说明该位点受到漂变、选择和引种等因素的影响。这与Roy等［6］和Chirala等［7］的研究结果存在一定的差异；而与马彦南等［5］的研究结果较为一致。造成这种结果的原因可能是试验群体的环境和种群存在差异，也可能是中国荷斯坦牛含有地方黄牛品种血统。本研究在试验群体中仅发现一个个体为BB型，这可能是由于样本量限制的缘故。在遗传多态性分析中，等位基因数（Ne）、多态信息含量（PIC）和杂合度（He）都是群体内遗传变异的测度，其值的高低反映了群体遗传变异的大小，遗传变异大，数值越高。本研究试验群体PIC值小于0.25，呈低度多态，这与武秀香等［2］的研究结果存在一定差异，可能是由于A等位基因对荷斯坦奶牛的生长发育、泌乳性能有正效应，所以在长期的人工育种过程中受到正向选择、处于优势地位的缘故。

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S823.2

A

2095-3887（2017）03-0067-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.03.018

2017-04-13

任卫合（1997-），男，在读本科生。

张丽（1980-），女，副教授，博士。研究方向：牛羊遗传育种。