仿生蜂巢花粉制备方法及其活性成分测定的研究

杨茂森 张世文 王鑫 刘占莉

（甘肃省蜂业技术推广总站，天水741020）

仿生蜂巢花粉制备方法及其活性成分测定的研究

杨茂森 张世文 王鑫 刘占莉

（甘肃省蜂业技术推广总站，天水741020）

蜂巢花粉是蜜蜂真正的天然食物，是蜜蜂采集植物花粉过程或在蜂房内掺入自身唾液与蜂蜜后酿造成熟的产品，蜜蜂及其幼虫缺食蜂巢花粉，将造成群势下降、幼虫不能完全羽化。根据蜜蜂酿制花粉的原理，我们采用多级发酵技术，确立了仿生蜂巢花粉的制备方法；通过蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉（三种材料都是油菜花粉）对比研究试验，发现仿生蜂巢花粉中的活性化学成分含量高于蜂花粉、蜂巢花粉的含量。通过对不同花粉淀粉酶、蛋白酶的对比检测试验，发现仿生蜂巢花粉中这两种活性酶的含量与蜂巢花粉的含量十分接近。本研究为进一步开发活性仿生蜂巢花粉制剂及其单一活性物质产品提供了理论依据。

蜂花粉；蜂巢花粉；仿生蜂巢花粉；淀粉酶；蛋白酶

花粉为植物的雄性生殖细胞，它具有很高的营养价值和药用价值。现代医学研究证实：花粉具有预防脑心血管疾病、降血脂，调节神经系统，促进睡眠，调节胃肠系统功能，促进消化，治疗习惯性便秘；在调节内分泌、提高机体免疫功能、抗衰老、改善性功能、治疗男性不育、前列腺炎症等方面有一定的效果，具有防癌抑癌、保肝护肝、防止贫血、糖尿病、抗疲劳、养颜美容等功能而倍受人们的关注和应用[1-6]。蜂花粉是经蜜蜂采集的花粉，在蜂箱巢门口人工脱取的花粉被称为“蜂花粉”，经蜜蜂采集带回巢内酿造成熟的花粉被称为“蜂巢花粉”，蜂巢花粉是蜂花粉在巢脾蜂房内被蜜蜂加入自身唾液和蜂蜜后，得以酿熟的天然产品。蜂巢花粉是蜜蜂真正的食物，具有很高的营养和药用价值。但是人类要享用蜂巢花粉，只能采取人工掏取的办法，经我们试验：一个劳力一天（8小时）的掏取量在350～450g左右，生产成本较高。如何批量生产出与天然蜂巢花粉活性成分接近的产品，是本研究要解决的问题。

我国是世界第一养蜂大国，蜂花粉产量及出口量均居世界首位。据2009年统计数据：我国蜂花粉年产量超过13500吨，产量位居世界第一，其中一部分用于保健食品或药品，一部分用于出口外销，绝大多数被用做蜜蜂过冬时的“口粮”。我国可开发利用的蜂花粉数量在600吨以上，如果采用仿生蜂巢花粉的制备方法，可增进吸收，使其附加值得以大幅提高，从而带动提升国内养蜂业的经济效益。我国仿生蜂巢花粉产品研发刚刚起步，其发展前景十分远大[7]。

1 仪器与材料

紫外光谱仪：UV-2001型紫外光谱仪（日本日立公司）；Surveyor高效液相色谱分析仪（Thermo Finnigan）；冻干机；

油菜（Brassica campestris L）蜂花粉、天然蜂巢花粉均由甘肃耐克特蜂产品有限公司采集并通过兰州大学药学院马志刚教授鉴定。

酵母菌：安琪酵母股份有限公司提供；乳酸菌：河南君安生物技术有限公司提供；芦丁标准品：成都曼思特生物科技有限公司；葡萄糖标准品:成都曼思特生物科技有限公司；甲醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；硝酸铝：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；NaOH:分析纯，国药集团化学试剂有限公司；苯酚:分析纯，国药集团化学试剂有限公司；硫酸:分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

2 试验方法与分析

2.1 仿生蜂巢花粉的制备方法

蜂花粉的称量、灭菌：从冷库称取油菜蜂花粉，精选除杂，经臭氧杀菌机灭菌，使原料蜂花粉达到食品安全卫生要求。

脱敏处理：按蜂花粉重量的15～30%喷洒生理盐水，搅拌均匀后，在温度为28～38℃条件下培养48～72小时，完成第一级处理。

蜂巢花粉液处理：对完成第一级处理蜂花粉，按每份1 kg均匀喷洒200～300 ml蜂巢花粉培养液，在温度为28～35℃条件下培养48～72小时，完成第二级处理。

天然蜂巢花粉液的准备方法：用蒸馏水制成5%浓度的灭菌蜂花粉液,用蜂蜜调节其糖度18%，然后加入天然蜂巢花粉，天然蜂巢花粉含量达12%（w/v）以上，调节pH值在3.5，在恒温箱28～35℃条件下培养3天，得到天然蜂巢花粉液。

酵母菌液处理[8，9]：对完成第二级处理的蜂花粉，按每份1kg均匀喷洒200～300ml酵母菌液，在温度为28～35℃条件下培养48～72小时，完成第三级处理。

酵母菌液的准备方法：用蒸馏水制成5%浓度的灭菌蜂花粉液,用蜂蜜调节其糖度在18%，调节pH值在3.5，在恒温箱28～35℃条件下自然接种培养5天,得到酵母菌培养液。

乳酸菌液处理[9，10]：对完成第三级处理的蜂花粉，按每kg均匀喷洒200～300ml乳酸菌液，在温度为28～35℃条件下培养48～72小时，完成第四级处理。

乳酸菌液的准备方法：用蒸馏水制成5%浓度的灭菌蜂花粉液，量取加入天水当地浆水菜汁，浆水菜汁含量为25%（v/v），在恒温箱25～30℃条件下培养3天，得到乳酸菌培养液。

真空冻干：完成第四级处理的蜂花粉，用60目的纱网制成小颗粒后，进行真空冻干处理36～48小时，温度控制在-55～-65℃之间，真空度为-0.009MPa，使花粉中含水量在3～5%即可。

灭菌：将完成冻干的蜂花粉置于臭氧灭菌罐中灭菌，灭菌时间为50分钟，完成灭菌后装入洁净食品袋中备用,即生产出冻干活性仿生蜂巢花粉。

2.2 油菜蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分对比检测

油菜蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分对比采用高效液相色谱测定[11]，其色谱条件为色谱柱：Hypersil GOLD C18 2.1×150mm；柱温：25℃；流动相：甲醇：0.1%磷酸=45：55；检测器：UV和PDA；进样量：5μl。

图1 油菜蜂花粉高效液相色谱

图2 油菜天然蜂巢花粉高效液相色谱

2.2.1 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分检测方法

分别准确称取蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉相同质量，定容于50ml，取5 μl进样分析，得到如下色谱图：蜂花粉见图1、天然蜂巢花粉见图2、仿生蜂巢花粉见图3。

2.2.2 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分对比分析

由表1可知，根据色谱分析的色谱峰保留时间和色谱峰面积对照分析，仿生蜂巢花粉与天然蜂巢花粉之间的活性物质出峰位置完全一样，活性物质非常接近，而仿生蜂巢花粉与蜂巢花粉之间的活性物质出峰位置也基本一样，仅差一个峰的区别，其他活性物质非常接近；同时还发现仿生蜂巢花粉各活性物质的色谱峰面积有所增加，说明其活性物质的含量有所增加，仿生蜂巢花粉可以完全替代蜂巢花粉和蜂花粉。

2.2.3 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉的总黄酮对比测定

2.2.3.1 测定方法

(1)芦丁标准曲线的制作[12]

称取0.0099 g芦丁溶解于100 ml甲醇溶液，摇匀，得标准液；取标准液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分别置于10 ml容量瓶中，加入蒸馏水使成5 ml；精密加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 ml，摇匀，放置5min；再加入10%硝酸铝溶液0.3 ml,摇匀，放置6min；再加入4% NaOH溶液4 ml；各用蒸馏水定容至刻度线，摇匀，放置10min。在510nm处测定吸光度，制作标准曲线。

（2）实验组

称取仿生蜂巢花粉0.0275 g，用甲醇定溶至50 ml容量瓶中；称取蜂花粉0.0126 g，用甲醇定容至50 ml容量瓶中；称取天然蜂巢花粉0.0249 g，用甲醇定容至50 ml容量瓶中备用。

取仿生蜂巢花粉、蜂花粉和天然蜂巢花粉甲醇溶液5 ml加入到10 ml容量瓶，加入蒸馏水使成5 ml；精密加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 ml，摇匀，放置5min；再加入10%硝酸铝溶液0.3 ml,摇匀，放置6min；再加入4%NaoH溶液4 ml；各用蒸馏水定容至刻度线，摇匀放置10min。在510nm处分别测定吸光度。

表1 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉之间活性物质含量峰值面积对比表

2.2.3.2 实验结果

依据标准曲线测定蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉总黄酮含量见表2。

2.2.4 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉总多糖对比测定

(1)测定方法—标准曲线的制作

准确称取葡萄糖标准品适量，配制成含量为129.465mg/l标准溶液，分别移取该标准溶液0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml于具塞比色管，各精密加入5.0%苯酚溶液1.0 ml，摇匀，迅速精密加入硫酸5.0 ml，摇匀，放置10分钟，置于40℃水浴中保温15分钟，取出迅速冷却至室温，以相应试剂为空白，依照紫外可见光谱仪在490nm波长处测定吸光度检测，系列标准溶液葡萄糖含量分别为：25.893μg、51.786μg、77.697μg、103.572μg、129.1975μg、258.93μg，测得该系列标准溶液吸光度值分别为：0.291、0.429、0.553、0.707、0.829、1.197、1.468，空白溶液吸光度值为0.125，得标准曲线如下图：

（2）蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉总多糖测定

依据标准曲线测定蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉总多糖含量见表3。

图3 油菜仿生蜂巢花粉高效液相色谱

2.2.5 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉淀粉酶、蛋白酶的对比测定

淀粉活性酶测定按GB/T18932.16-2003方法，蛋白活性酶测定按GB/T23527-2009方法进行测定，测定结果见表4：

表2 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉的总黄酮含量结果

表3 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉的总多糖含量结果

表4 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉淀粉酶、蛋白酶测定结果

3 结论

蜂巢花粉是蜜蜂真正的天然食物，是蜜蜂采集植物花粉过程或在蜂房内掺入自身唾液与蜂蜜后酿造成熟的产品，蜜蜂及其幼虫缺食蜂巢花粉，将造成群势下降、幼虫不能完全羽化。根据蜜蜂酿制花粉的原理，我们采用多级发酵技术确立了仿生蜂巢花粉的制备方法；通过蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉（三种材料都是油菜花粉）对比研究试验，根据色谱分析的色谱峰保留时间和色谱峰面积对照分析，仿生蜂巢花粉与天然蜂巢花粉之间的活性物质出峰位置完全一样，活性物质成分非常接近，而仿生蜂巢花粉与蜂巢花粉之间的活性物质出峰位置也基本一样，仅差一个峰的区别，其他活性物质成分也非常接近；同时还发现，仿生蜂巢花粉各活性物质的色谱峰面积有所增加，说明其活性物质的含量有所增加，因此仿生蜂巢花粉可以完全替代蜂巢花粉和蜂花粉。同时，还发现仿生蜂巢花粉中的活性化学成分含量高于蜂花粉、蜂巢花粉的含量，另外通过对不同花粉淀粉酶、蛋白酶的对比检测试验，发现仿生蜂巢花粉中，这两种活性酶的含量与蜂巢花粉的含量十分接近。

致谢：本课题研究受甘肃省科技支撑计划《多级仿生蜂花粉的制造及其制剂的制备研究》（No：0708NKCE080，2009-2011）、《仿生蜂花粉系列制剂产业化开发》（No：1204 NKCE102,2012-2014）及《天水蜂产品品质优化工艺技术研究与开发》（No：144NKCE244,2014-2015）的支持，表示感谢。

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