基于GC-MS的灰葡萄孢菌代谢组分析

胡志宏，常旭念，代 探，吴嘉纯，刘鹏飞

(中国农业大学 植物保护学院，北京 100193)

基于GC-MS的灰葡萄孢菌代谢组分析

胡志宏，常旭念，代 探，吴嘉纯，刘鹏飞*

(中国农业大学 植物保护学院，北京 100193)

对农作物重要病害灰霉病的致病菌——灰葡萄孢菌进行了代谢组提取溶剂、衍生化时间和温度等前处理条件以及内标物筛选优化。结果表明，以水杨苷作为内标物，试验条件下以甲醇-水(80∶20)为提取溶剂，按照4.0 mL/0.1 g菌丝的剂量进行提取，采用N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺和甲氧基胺盐酸盐在37 ℃和6 h条件下进行衍生化，可实现多种代谢物衍生产物收率和稳定性的最优化。灰葡萄孢菌丝代谢组的检测获得了210个峰，其中50种代谢物与NIST 2008的匹配度达到80%以上，主要为氨基酸类、醇类、有机酸类、糖类等代谢物，并通过标准品对部分代谢物进行了定性。典型的17种代谢物在1.0～100 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.98，检出限为0.02～10.0 ng/mL，定量下限为0.1～34.0 ng/mL。方法精密度分析结果显示89.05%代谢物的相对标准偏差为0.01%～16.8%。所建立的方法适合于丝状真菌的代谢组检测，可为农业和医学领域开展微生物代谢组研究提供参考。

灰葡萄孢菌；代谢组；样品前处理；硅烷化

农田十大病害之一灰霉病致病菌灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)寄主范围广且变异能力强，给农业生产造成了严重的危害[1]，对其常用的杀菌剂极易产生抗药性，需不断开发新型杀菌剂以有效控制该病害的田间危害。近年来，代谢组学的发展为揭示有机体的生命信息带来了新的机遇[2-4]。病原菌的代谢组研究对揭示病原菌不同生长发育过程的代谢信息[5]，探索病原菌侵染植物过程相关的代谢物[6]及代谢途径，分析潜在的药物靶标等具有重要意义。

有关医学样本、植物样本和微生物样本代谢组的分析方法，国内外已有不少报道[7-10]，核磁共振(NMR)[11]、气相色谱-质谱联用(GC-MS)[12]、液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)[13]等分析平台被广泛应用于这一研究领域，各项技术互为补充[14]，揭示了更为全面的生物样品的代谢组信息[15]。对病原菌代谢组的解析可提供其不同生长发育阶段密切相关的代谢信息[15-16]，而GC-MS凭借其高分离能力及化合物数据库资源在代谢组分析中表现出独特的优势。在采用代谢组信息解释生物学现象之初，科研工作者面临的一个重要问题即如何对生物样本的代谢组进行准确的定性和定量[17]。已有文献[18]认为在N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSTFA)衍生化反应体系中，反应时间对不同类别的代谢物反应收率存在较大影响，且内标物对仪器和试验方法的校准具有重要作用。此外，一般认为提取溶剂的极性决定了可提取代谢物的极性范围[19]。

关于灰葡萄孢菌代谢组研究方面，目前国内外对该病原微生物本身的代谢组研究鲜有报道，相关文献多为通过分析灰葡萄孢菌侵染的寄主植物的代谢组(如葡萄[6]以及模式植物拟南芥[20]等)，进而研究病原与寄主互作关系。基于GC-MS的B.cinerea代谢组检测尚缺乏系统可靠的方法，且前期研究显示，常被用作内标的核糖醇[21]由于背景干扰不宜用于B.cinerea代谢组分析。本文对B.cinerea菌丝的代谢组的提取、衍生化、GC-MS检测方法的影响因素进行研究，以期建立适用于丝状真菌的代谢组检测方法，进而为微生物深入研究及应用提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

无菌操作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；20 ℃恒温培养箱(天津市泰勒斯特仪器公司)；分析天平(北京市丹佛仪器有限公司)；涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；真空离心浓缩仪(湖南赫西仪器装备有限公司)；球磨仪(Restsch公司)；超低温冰箱(Thermo公司)；离心机(Sorvall公司)；GC-MS仪(6890N/5973，安捷伦公司)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；水(Milli-Q纯水仪制备)；N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSTFA，含1 %TMS)、吡啶、甲氧基胺盐酸盐(分析纯，Sigma-Aldrich公司)；1，3-丙二醇、核糖醇、肌醇、水杨苷、D-葡萄糖、D-果糖、D-吡喃甘露糖、L-丙氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、丝氨酸、L-天冬氨酸、L-缬氨酸、L-葡萄糖酸、DL-苹果酸、柠檬酸、十六烷酸、硬脂酸、琥珀酸、延胡索酸标准品购于Sigma-Aldrich公司。

B.cinereaS28，采自沈阳农大试验田，寄主为番茄，由北京擎科新业生物技术有限公司鉴定，经核糖体内转录间隔区(ITS)及核蛋白编码基因(G3PDH、HSP60和RPB2)鉴定为B.cinerea[22]。

1.2 实验方法

1.2.1 菌丝培养与收集 采用PDA培养基培养B.cinerea菌株3 d后，用0.5 cm打孔器沿着菌落外沿制取菌饼，用挑针挑取菌饼并接到铺有玻璃纸的固体PDA培养基平板上，19.5～20.5 ℃条件下培养3 d。用干净的解剖刀刮取玻璃纸上生长的菌丝培养物，去除接种的菌饼，称取(100.0±0.5) mg收集于2 mL离心管中，将装有菌丝的离心管迅速置于液氮中速冻3～5 min灭活，置于-80 ℃冰箱保存。

通过梳理中共十二大以来党的文献资料可以看出，中国特色社会主义的内涵主要是从建设道路、建设事业、理论体系、政治旗帜等方面被加以阐释的。

1.2.2 代谢组提取及衍生化方法 取保存的菌丝样品，采用球磨仪以30次/s的频率研磨2 min进行破碎处理，得菌丝粉末，加入2 mL提取溶剂(提取溶剂在-20 ℃保存30 min以上，冰上操作)[6]，涡旋振荡1 min后，继续超声提取20 min。将提取获得的代谢组溶液在12 000 r/min下离心15 min，准确移取0.6 mL上清液至离心管中，45 ℃抽真空离心干燥8 h以上至质量恒定。

衍生化包括肟化和硅烷化两步反应：准确吸取100 μL衍生化试剂甲氧基胺盐酸盐溶液(溶解于吡啶中，浓度为20 mg/mL)加入已离心干燥的样品管中，封口，超声20 min，涡旋1 min，稍微离心，30 ℃衍生化反应2 h；再加入100 μL衍生化试剂BSTFA至样品管中，封口，超声20 min，涡旋1 min，稍微离心，37 ℃衍生化反应6 h。获得的衍生化样品在12 000 r/min下离心15 min，吸取160 μL至GC自动进样瓶中，4 ℃保存并于48 h内检测。

1.2.3 提取溶剂及剂量的选择 分别用强、中、弱3种极性溶剂提取菌丝代谢组，即：I组为甲醇水(80∶20，体积比，下同)，Ⅱ组为甲醇-乙酸乙酯(50∶50)，Ⅲ组为乙酸乙酯。提取剂量按照4.0 mL对(100.0±0.5) mg的菌丝培养物进行代谢组的提取和检测，比对不同溶剂对B.cinerea菌丝代谢组提取范围的影响。

1.2.4 衍生化温度及时间对代谢组分析的影响 在硅烷化反应过程中，分别在37，50，70 ℃条件下，经过2，3，4，6，8，10 h衍生化反应后检测，考察了反应温度和时间对代谢物衍生化产物峰面积的影响。

1.2.5 内标物质的选择 根据文献报道选择4种常用于代谢组GC-MS检测的内标物质：1，3-丙二醇[23]、核糖醇[21]、肌醇[24]和水杨苷[25]，分别添加提取溶剂进行菌丝代谢组提取分析，与不加内标的样品比对，以菌丝中不存在的内标物作为B.cinerea分析的内标物。

1.2.6 GC-MS检测条件 Agilent Technologies 6890N气相色谱仪，Agilent Technologies 5973质谱仪。检测条件为：HP-5MS毛细管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；进样体积1 μL；载气流速1 mL/min；离子源和传输线温度分别为230 ℃和280 ℃；氦气为载气，恒流模式；质谱EI电离源70 eV，全扫描范围m/z20～650，频率0.2 s/scan；溶剂延迟时间5.5 min。色谱柱梯度升温程序：65 ℃保持2 min，以5 ℃/min速率升至185 ℃，以1 ℃/min升至200 ℃，以15 ℃/min升至280 ℃，保持25 min。

1.2.7B.cinerea代谢组的定性分析 采用GC-MS数据分析软件(增强型ChemStation MSD ChemStation E.02.01.1177)对GC-MS检测数据进行保留时间和峰面积数据的导出。在典型样品检测TIC图谱中，选取1个特征离子峰和2个参考离子峰作为定性离子，并以特征离子峰作为定量离子，编辑所有代谢物信息，并对代谢物进行峰面积积分。

1.2.8 代谢组分析方法学考察 以衍生化试剂20 mg/mL甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液-BSTFA(1∶1)配制0.001，0.01，0.1，1.0，10，100 μg/mL的17种标准品系列溶液分别进行测定，以定量离子峰面积对质量浓度进行线性回归，检测各代谢物的线性范围，进一步进行浓度梯度稀释，以信噪比S/N=3的浓度作为检出限。以各代谢物与内标物质的相对峰面积计算6次重复间的相对标准偏差，以考察方法的重现性。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

采用极性不同的提取溶剂Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ提取B.cinerea菌丝代谢组(实验步骤参见“1.2.3”)，经衍生化和GC-MS检测获得不同溶剂提取后的总离子流图。结果显示，经溶剂Ⅰ提取获得210个峰，溶剂Ⅱ获得127个峰，溶剂Ⅲ获得72个峰。通过定性分析，溶剂Ⅱ和Ⅲ提取到的代谢物谱完全包含于提取溶剂Ⅰ中。实验结果表明，以极性最强的甲醇-水溶剂获得代谢物质的数目最多，远大于乙酸乙酯提取到的代谢物数量，且可以覆盖甲醇-乙酸乙酯和乙酸乙酯两种溶剂提取到的代谢物谱。

通过NIST谱库检索，由甲醇-水提取到的B.cinerea代谢组主要成分为糖类、氨基酸类、有机酸类、醇类、酯类等物质。而乙酸乙酯提取代谢组的总离子流图上缺少的物质主要是氨基酸类和糖类物质，可能因为乙酸乙酯对氨基酸类和糖类物质的提取效果差。有学者[26]采用不同配比的甲醇、水、氯仿来提取葡萄果实的代谢组，发现甲醇-氯仿-水(40∶40∶20)的提取效果最好，与本研究采用的甲醇水溶剂体系的极性略有差异。

2.2 衍生化温度与时间对代谢组分析的影响

在不同时间和温度组合的衍生化条件下，GC-MS检测到的大部分代谢物随温度和反应时间变化表现出相似的变化规律。结果显示，在37 ℃反应温度下，2～4 h内随着衍生化时间的增加，大部分代谢物的衍生产物含量逐渐增加，而反应4～10 h内相对含量变化不显著，这与文献[18]报道结果一致。如氨基酸类缬氨酸(L-Valine)、异亮氨酸(L-Isoleucine)、脯氨酸(L-Proline)、甘氨酸(Glycine)和苏氨酸(L-Threonine)，醇类的阿拉伯糖醇(Arabitol)，有机酯类的甘油磷酸酯(Phosphoglyceride)，糖类的葡萄糖(D-Glucose)，有机酸类的丁二酸(Butanedioic acid)衍生化产物的峰面积变化均小于1%。50 ℃和70 ℃反应条件下，大部分物质在反应2 h后达到平衡，代谢物相对含量趋于稳定，但部分代谢物在衍生化反应4～10 h后产物含量仍不稳定。50 ℃条件下异亮氨酸上调了12%，硬脂酸(Octadecanoic acid)上调了37%；70 ℃条件下异亮氨酸上调了25%，硬脂酸上调了53%，脯氨酸下调了39%，葡萄糖下降了18%。因此，37 ℃下大部分代谢物在6 h后即可达到反应平衡，且产物较稳定。因此，本实验采用37 ℃衍生化6 h。

2.3 内标物质的选择

经GC-MS检测，在本实验条件下，1，3-丙二醇、核糖醇、肌醇和水杨苷衍生化产物的出峰时间分别为9.27，24.75，34.80，45.90 min。分别提取每一种标准物质和菌丝代谢组的质谱特征离子进行比对，其中1，3-丙二醇衍生化产物的特征离子m/z为75，105，133；核糖醇衍生化产物的特征离子m/z为217，103，147；肌醇衍生化产物的特征离子m/z为313，217，305；水杨苷衍生化产物的特征离子m/z为361，147，217。结果显示，B.cinerea代谢组样品中，1，3-丙二醇、核糖醇和肌醇均被检出，而水杨苷的保留时间附近未检出干扰峰，因此选择水杨苷作为B.cinerea代谢组GC-MS检测的内标物质。

2.4 线性范围、检出限及定量下限

以衍生化试剂20 mg/mL甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液-BSTFA(1∶1)配制浓度为0.001～100 μg/mL的17种标准品系列溶液分别进行测定，以定量离子峰面积(y)对质量浓度(x，μg/mL)进行线性回归(见表1)。结果表明，17种标准品在1.0～100 μg/mL范围内线性关系良好(r2≥0.983 5)，各标准品的检出限为0.02～10.0 ng/mL，定量下限为0.1～34.0 ng/mL，该方法显示了较高的灵敏度。

表1 17种代谢物的标准曲线、检出限及定量下限Table 1 Calibration curves，LODs and LOQs of 17 metabolites

图1 B.cinerea代谢组典型总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram from metabolome of B.cinerea

2.5 重现性分析

通过GC-MS检测获得了B.cinerea的菌丝代谢组，其典型色谱图如图1所示。共检出210个峰，其中与NIST 2008匹配度≥80%的代谢物有50个。主要包含氨基酸类11个、醇类3个、糖类8个、烷烃类2个、有机酸类14个、有机酯类2个、其它类别10个等物质。通过比对相同检测条件下样品与标准物质的保留时间和质谱特征离子定性了17种代谢物。这些代谢物的化学类别、中英文名称、保留时间、与NIST 2008匹配度及其特征离子等详细信息见表2。

采用优化的代谢组检测方法，对B.cinerea做6次重复检测定性分析后，进行代谢组重现性分析。结果显示，该方法的重现性较好，89.05%的代谢物的相对标准偏差(RSD)为0.01%～16.8%。有学者基于GC-MS对人体血浆代谢组进行研究，对32种典型代谢物进行重现性分析，其RSD为3.7%～28.9%[27]。研究结果表明所建立的方法优于文献报道。

表2 B.cinerea菌丝代谢组信息Table 2 Information about metabolome of B.cinerea mycelium

(续表2)

ChemicalclassesCompoundRetentiontime(min)Matchquality(%)Characteristicions(m/z)aMonoethanolamine(乙醇胺)12 56096174，175，147Spiro[benzofuran⁃2(3H)，1′⁃[3]cyclohexene]⁃2′，3⁃di⁃one，4′，6，6′⁃trimethoxy⁃4⁃methyl⁃47 21190318，220，181Uridine(尿苷)44 49195217，103，218

a:the characteristic ions of derivative products，*:metabolites confirmed with standards(a表中所列为各代谢物衍生化产物特征离子，*标注的代谢物经过标准品验证)

3 结 论

本文对B.cinerea菌丝样品的前处理及气相色谱-质谱联用分析方法进行了研究，对B.cinerea菌丝代谢组的提取、衍生化条件等进行了优化，并筛选了适合于B.cinerea菌丝代谢组GC-MS检测分析的内标物质。此外，在铺有玻璃纸的固体培养基上培养B.cinerea菌丝，有效扣除了培养基基质对B.cinerea代谢组分析的影响，所建方法对微生物中主要代谢物种类如糖、氨基酸、醇、有机酸、烷烃、酯等均可检出。方法学考察结果表明，该方法灵敏度高且重现性良好，可以满足代谢组学研究高通量、高灵敏度和重现性的要求，适合于包括B.cinerea在内的丝状真菌的代谢组学研究，可为杀菌剂作用于灰霉菌代谢组机制研究、灰霉菌侵染寄主生物标志物研究提供基础，并为农业和医学领域开展微生物代谢组相关研究提供了参考。

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Application of GC-MS inBotrytiscinereaMetabolome Analysis

HU Zhi-hong，CHANG Xu-nian，DAI Tan，WU Jia-chun，LIU Peng-fei*
(College of Plant Protection，China Agricultural University，Beijing 100193，China)

The pretreatment conditions，including extraction solvent，derivatization time and temperature，as well as internal standard were optimized for metabolome analysis ofBotrytiscinerea(B.cinerea)，an important pathogenic fungus that could induce a severe grey mold on plants.The results showed that，using salicin as the internal standard，a mixture of methanol and water(80∶20) with a dosage of 4.0 mL for 0.1 g of mycelium as extraction reagent，a silylation of N，O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with methoxylamine for 6 h of derivation at 37 ℃ was the optimal for most kinds of metabolites in derivatives yield and stability.InB.cinereahypha metabolome，210 peaks were detected by GC-MS， and the metabolome was identified as a group of metabolites including mainly amino acids，alcohols，organic acids，sugars and others.Among the metabolites，50 of them were identified by NIST 2008 with a match quality of 80% or more, and part of them by standards.As a result，typical 17 metabolites obtained good linearities in the range of 1.0-100 μg/mL with correlation coefficients more than 0.98.The limits of detection and limits of quantitation were in the range of 0.02-10.0 ng/mL and 0.1-34.0 ng/mL，respectively.Investigation on the reproducibility of the optimal method suggested that the RSD for 89.05% metabolites detected were in the range of 0.01%-16.8%.The good reproducibility implied that the method established was suitable for the metabolome detection of mycelial fungi,and could provide a good reference for microorganism metabolomics research in the field of agricultural and medical science.

Botrytiscinerea；metabolomics;sample pretreatment;silylation

2016-09-06；

2017-01-22

公益性行业(农业)科研专项经费项目(201303025)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.009

O657.63；Q939.51

A

1004-4957(2017)05-0633-07

*通讯作者：刘鹏飞，博士，副教授，研究方向：植物病理学与杀菌剂药理学，Tel：010-62731226，E-mail：pengfeiliu@cau.edu.cn