嘎狗噜对肢体缺血再灌注损伤大鼠的抗炎作用研究

王济纬 兰 俊 许荣成 邓连成 刘 斌 鄢连和 陈科 雷后兴

·药学研究·

嘎狗噜对肢体缺血再灌注损伤大鼠的抗炎作用研究

王济纬 兰 俊 许荣成 邓连成 刘 斌 鄢连和 陈科 雷后兴

大鼠；再灌注损伤；嘎狗噜；炎症因子

肢体缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）是一种临床常见损伤，处理不当会引起严重的临床后果。其病理生理机制十分复杂，包括细胞凋亡、氧化应激、钙超载、血管内皮损伤、缺血后的微循环障碍等方面，而炎症反应在其发生发展过程中起着重要的作用[1-2]，发生IRI会刺激机体炎性细胞在肢体的聚集，同时表达产生大量的炎性细胞因子，而这些炎性因子反过来刺激更多的炎性反应，加重再灌注损伤。研究[3]发现，细胞间黏附分子-1（ICAM-1）在其中起着非常重要的作用。文献[4-5]报道，畲药嘎狗噜（地稔，Melastoma dodecandrum Lour，MDL）具有抗炎作用。本实验观察畲药嘎狗噜水煎液对肢体缺血再灌注损伤大鼠炎症反应的影响及作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物8周龄清洁级健康SD大鼠，体质量200～250g，雌雄各15只，温州医科大学实验动物中心提供。许可证号：SYXK（浙）2010-0150。适应性饲养，雌雄分养，实验前夜禁食，自由饮水。

1.2 畲药配置MDL全草由丽水市畲族医药研究所提供。取MDL原药材1kg，剪碎后分别以10倍量、8倍量、6倍量水煎煮3次，每次30min，合并3次煎煮液滤过、离心，浓缩至1g生药/mL的MDL浓缩液置于冰箱冷藏备用，实验用MDL水煎液由MDL浓缩液+纯水稀释配制而成，浓度0.2g/mL。灌胃剂量为1次10mL/kg，1天1次。

1.3 实验仪器及试剂南京SOPTOP舜宇显微镜ST60，上海手术器械厂800型离心机，Mutuskan MK3酶标仪。Multi sciences公司生产的细胞间黏附分子-1（ICAM-1，批号238960234）、白细胞介素-6（IL-6，批号230660752）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α，批号238260734）试剂盒。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及造模30只SD大鼠分为假手术组、模型组和药物组，每组10只。大鼠术前禁食12h，自由饮水，术前10%水合氯醛3mL/kg腹腔内注射麻醉。每2h追加1次维持麻醉，剂量减半。麻醉成功后，大鼠仰卧位，四肢固定于木板上，取右腹股沟切口，常规备皮、消毒、铺巾，剪开皮肤，在手术显微镜下显露股动、静脉及股神经，分离出右侧股动脉。假手术组仅单纯游离股动脉，不阻断，直接缝合皮肤。模型组和药物组大鼠用无创动脉夹夹闭右侧股动脉，显微镜下确认阻断动脉血流后，缝合切口两针，再次消毒。同时予以右大腿根部橡皮带环扎，阻断侧支循环。4h后松解橡皮带，拆线，取出动脉夹，并检查血管是否通畅，以确认恢复右下肢血流灌注，缝合创口。药物组造模后第2天开始灌胃中药，另两组灌胃等量生理盐水，每天1次，共喂5天；第6天三组大鼠麻醉后，心尖取血，检测相关指标。

1.4.2 血浆组织细胞因子水平检测取血4mL入促凝管（促凝剂+分离胶）,静置30min待血清部分析出后，再予离心机离心，3000rpm，10min。分离血清后装入无菌Epperdorf管置于-75℃超低温冰箱中保存，统一检测。ICAM-1、IL-6、TNF-α浓度均采用ELISA法检测，严格按照试剂盒说明书操作。将血清标本从-75℃超低温冰箱中取出，缓慢恢复至室温；准备所有试剂和标准品；复孔加入100μL两倍倍比稀释的标准品；样本孔加入50μL 1×检测缓冲液和50μL样本；每孔加入50μL稀释的检测抗体；室温孵育2h；洗涤6次；每孔加入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；室温孵育45min；洗涤6次；每孔加入100μL显色底物，避光，室温孵育20min；每孔加入100μL终止液；30min内，在450nm波长检测OD值，参考波长630nm。

根据标准品浓度和相应的OD450吸光值制定标准曲线；根据标准曲线计算样本的ICAM-1、IL-6、TNF-α浓度。

1.5 统计学方法应用SPSS19.0统计软件，计量资料均以均数±标准差表示，采用t检验法，以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

模型组ICAM-1含量与假手术组比较显著升高（P<0.05），模型组IL-6、TNF-α与假手术组比较有非常显著升高（P<0.01）。药物组ICAM-1、IL-6、TNF-α与模型组比较均有非常显著降低（P<0.01）。见表1。

表1 MDL提取液对肢体IRI模型大鼠血清炎性因子的影响

表1 MDL提取液对肢体IRI模型大鼠血清炎性因子的影响

注：与假手术组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01. ICAM-1：细胞间黏附分子-1；IL-6：白细胞介素-6；TNF-α：肿瘤坏死因子-α

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3 讨论

缺血再灌注损伤可在全身多部位发生，肢体、心脏、肝脏、肺脏、脑部、肾脏、小肠等都是好发部位[3，6-7]，同时这些部位的再灌注损伤又会影响全身相关重要器官及系统，严重者会导致全身性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），处理不及时可造成持续的不可控的炎症反应，其产生的炎性介质会影响内皮细胞功能，并影响重要器官微循环，引起凝血功能障碍，导致多脏器功能障碍综合征（MODS）[8]。

嘎狗噜系畲族民间的常用药物，具有解毒消肿、祛瘀活血之功能。ICAM-1参与免疫应答和调节炎症反应。ICAM-1、IL-6和TNF-α作为经典的炎症因子指标，可以准确表达炎症反应的强弱。本实验通过钳夹股动脉及橡皮片捆扎肢体造成大鼠缺血再灌注损伤，造模后相关指标升高，成功造成肢体缺血再灌注损伤动物模型。本研究发现，MDL水煎提取液能够明显减少血液中炎症因子的表达，表明MDL水煎提取液可以通过降低炎症因子的表达抑制大鼠炎症反应。

［1］Furuichi K，Wada T，Kaneko S，et al.Roles of chemo-kines in renal ischemia/reperfusion injury［J］.Front Biosci，2008，13：4021-4028.

［2］Thurman JM.Triggers of inflammation after renal ischemia/ reperfusion［J］.Clin Immunol，2007，123（1）：7-13.

［3］徐江，黄晓琳.高压氧对脑缺血再灌注大鼠核因子-k B及细胞间黏附分子-1表达的影响［J］．中华物理医学与康复杂志，2005，27（5）：259-262.

［4］雷后兴，鄢连和，李水福等.畲药地稔水煎液的镇痛抗炎作用研究［J］.中国民族医药杂志，2008，3（3）：45-47.

［5］周芳，张兴燊，张旖箫，等.地稔水煎液镇痛抗炎药效的实验研究［J］.时珍国医国药，2007，18（10）：2370-2371.

［6］王良荣，金立达，林丽娜，等.糖尿病对肢体缺血再灌注后患者炎症反应和肺功能的影响［J］.温州医科大学学报，2015，45（3）：194-196.

［7］王晓琴，陈丽.舒芬太尼预处理对老年人肢体缺血再灌注后肿瘤坏死因子-α和心肌肌钙蛋白I的影响［J］.中华临床医师杂志，2016，10（9）：1283-1286.

［8］北京市科委重大项目“MODS中西医结合诊治/降低病死率研究”课组．多器官功能障碍综合征诊断标准、病情严重度评分及预后评估系统和中西医结合证型诊断［S］．中国危重症急救医学，2008，20（1）：1-3.

（收稿：2016-10-12修回：2106-10-22）

浙江省丽水市重点创新团队项目（No.2012CXTD09-06）

浙江省丽水市人民医院（丽水323000）

雷后兴，Email：zjleihx@163.com