性别对小鼠急性心肌损伤后心脏结构与功能的影响

乔钰惠 朱宝玲 李子健

100191 北京大学第三医院心内科血管医学研究所 卫生部心血管分子生物学与调节肽重点实验室 分子心血管学教育部重点实验室 心血管受体研究北京市重点实验室

·基础研究·

性别对小鼠急性心肌损伤后心脏结构与功能的影响

乔钰惠 朱宝玲 李子健

100191 北京大学第三医院心内科血管医学研究所 卫生部心血管分子生物学与调节肽重点实验室 分子心血管学教育部重点实验室 心血管受体研究北京市重点实验室

目的 研究不同性别的小鼠在异丙基肾上腺素(ISO，非选择性β-肾上腺素受体激动剂)诱导的急性心肌损伤后心脏结构与功能改变的差异。方法 经皮下注射给予同周龄FVB/N雌雄小鼠大剂量ISO(200mg·kg-1·d-1，3d)，超声心动图检测心脏结构及心功能。检测血清乳酸脱氢酶(LDH)活性及心脏组织切片活性氧(ROS)生成。采用舒张末期左心室壁厚度、心体比、心胫比及心肌细胞横截面积作为心脏肥厚指标。采用天狼星红染色方法检测心脏纤维化。结果ISO(200mg·kg-1·d-1，3d)可引起FVB/N小鼠血清LDH活性明显增高，且雄鼠增高显著高于雌鼠。短期给予大剂量ISO可导致雄鼠的心脏组织切片ROS生成明显增加，但并没有使雌鼠心脏组织切片的ROS显著增加。另外，短期给予大剂量ISO诱导雄鼠和雌鼠均发生心脏肥厚，且雄鼠的肥厚程度显著高于雌鼠。而短期给予大剂量ISO不能诱导雌鼠和雄鼠的心脏发生纤维化，同时对雌鼠和雄鼠的心功能也无明显影响。结论 在ISO诱导的急性心肌损伤模型中，雄鼠的心脏肥厚程度显著高于雌鼠，其中的机制之一可能是通过ROS介导。而在此模型中雌雄鼠的心功能并无明显差异。

性别； 异丙肾上腺素； 急性心肌损伤； 心脏结构与功能

Fund program：National Basic Research Program of China (973) Program (2014CBA02000)；National Natural Science Foundation of China (81471893，81270157，81070078，91539123)

心血管疾病是导致人类死亡的首要病因，且患病率仍在持续增加。已有很多研究显示，性别因素在很多心血管疾病如心肌梗死和心脏重构的进展与预后中具有重要作用[1-4]。异丙基肾上腺素(isoprenaline，ISO)是β-肾上腺素受体(β-adrenergic receptor，β-AR)的非选择性激动剂，导致心脏处于应激状态，常被用于制造各种心血管疾病模型。而大剂量的ISO可引起冠状动脉的收缩与痉挛，导致心肌的缺血与损伤，故可被用于建立急性心肌损伤模型[5-7]。而性别对急性心肌损伤的具体影响及作用还不清楚，因此本研究采用大剂量ISO制备小鼠急性心肌损伤模型，进一步探究性别因素对ISO引起的急性心肌损伤后心脏结构与心功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

同样周龄(10～12周)、同样背景的FVB/N 雄鼠和雌鼠购自北京维通利华公司，饲养环境温度为25 ℃左右，12 h明/暗交替，所有动物实验遵守北京大学生物医学研究伦理要求。ISO(5627-5G)购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 FVB/N小鼠急性心肌损伤模型的制备

对实验小鼠进行完全随机化分组，将雌鼠和雄鼠各自分为对照组和实验组，每组8只。经皮下注射途径给药：实验组小鼠皮下注射ISO(200 mg·kg-1·d-1，3 d)；对照组小鼠注射等体积生理盐水。

1.3 FVB/N小鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)及心脏组织切片活性氧(ROS)检测

在最后1次给予ISO的第2天取材，取血及心脏。经眼球内眦取血，将全血置于冰上1 h后高速离心10 min(4 ℃，5 000 rpm)，取上层血清。用试剂盒Lactate Dehydrogenase Activity Assay Kit(Sigma-MAK066)检测血清与试剂反应一定时间后450 nm处的吸光度值，按照说明书中的公式计算LDH活性。

将麻醉后的小鼠胸腔剪开，取出心脏，用冷的PBS缓冲液冲洗心脏中的残留血液。经乳头肌切面横切心脏，将心底部分置于4%多聚甲醛中固定，6～8 h后取出，将心脏组织置于20%蔗糖溶液中。之后依次置入50%(2 h)、70%(3 h)、80%(3 h)乙醇溶液中梯度脱水，最后置于90%乙醇+正丁醇(体积比1∶1)溶液中，45 min，2次。正丁醇(30 min)、丁醇(20 min)，浸入石蜡中2 h包埋组织块，石蜡切片厚度5 μm。利用二甲苯将心脏组织石蜡切片脱蜡以后，给予二氢溴化乙啶(dihydroethidium，DHE；Invitrogen)荧光探针(10 μm)37 ℃孵育30 min，PBS清洗3次后，倒置荧光显微镜下观察荧光并采集图像，每张切片随机采集6～10个视野。采用Image-Pro Plus 6.0软件进行荧光强度定量分析。

1.4 FVB/N小鼠心脏肥厚的检测

于最后1次给予ISO的第2天取材时，称量小鼠体重及心脏重量。并取小鼠胫骨，测量其长度。计算心脏重量与胫骨长度比值(heart weight/tibia length，HW/TL，单位：mg/mm)及心脏重量与体重比值(heart weight/body weight，HW/BW，单位：mg/mg)作为衡量心脏肥大的指标。

1.5 FVB/N小鼠心脏纤维化的检测

将心脏石蜡切片进行苦味酸-天狼星红染色，以检测胶原分布。应用软件Image Pro Plus 6.0(Media Cybernetics Inc.，USA)分别测量胶原面积和心脏面积，并计算胶原面积占心脏面积的百分比。

1.6 FVB/N小鼠超声心动图的检测

在最后1次给予ISO的第1天对小鼠进行超声心电图检测。使用高分辨率小动物超声仪VisualSonics Vevo770及RMV707B高频线控探头(加拿大VISUALSONIC公司)采集FVB/N小鼠在1.5%异氟烷麻醉时的超声心动图像。将适量超声耦合剂涂抹于小鼠胸部，采用Vevo770超声仪，15 Hz探头探测胸骨旁左心室长轴切面、胸骨旁左心室短轴切面及四腔切面。测量小鼠舒张末期左心室后壁厚度(diastolic left ventricular posterior wall thickness，LVPW；d)、舒张末期左心室后壁厚度(systolic left ventricular posterior wall thickness，LVPW；s)、舒张末期左心室内径(left ventricular end-diastolic inner-diameter，LVID；d)和收缩末期左心室内径(left ventricular end-systolic inner-diameter，LVID；s)及二尖瓣血流E峰/二尖瓣环组织多普勒E′峰(E/E′)等值。并计算左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。每项参数均取连续3个心动周期的平均值。

1.7 心肌细胞横截面积检测

将心脏切片进行HE染色，高倍镜下拍照，随机选取视野6～8个，用Image Pro plus 软件分析心肌细胞横截面积。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 性别对ISO诱导的急性心肌损伤的影响

LDH在心肌细胞中的含量远高于其在血清中的含量，当心肌细胞受损破裂时，LDH释放入血，血清中的LDH活性增高。故LDH的活性可反映心肌细胞受损的情况。ISO组中LDH的活性明显高于对照组，且雄性ISO组的LDH活性显著高于雌性ISO组(图1 A)。

ROS是氧化应激的重要指标，而氧化应激可进一步加重心肌损伤。因此，心脏ROS的生成也可在一定程度上反映心肌受损的情况。给予FVB/N小鼠大剂量ISO后，雄鼠ISO组心脏组织切片的ROS生成明显增加，而雌鼠ISO组心脏组织切片的ROS生成无明显增加(图1B、C)。

2.2 性别对ISO诱导的急性心肌损伤后心脏肥大的影响

LVPW；d、HW/TL、HW/BW和心肌细胞横截面积均是衡量心肌肥厚的重要指标。ISO组小鼠的LVPW；d、HW/TL、HW/BW和心肌细胞横截面积均高于对照组小鼠，且差异有统计学意义。同时，雄性ISO组小鼠的LVPW；d(图2A、C)、心肌细胞横截面积(图2B、F)、HW/TL(图2D)、HW/BW(图2E)均明显高于雌性ISO组小鼠。

A：LDH活性统计图；B：ROS生成统计图；C：小鼠心脏组织切片DHE染色代表图；aP<0.05，bP<0.01图1 性别对ISO诱导的小鼠急性心肌损伤的影响(n=8)

2.3 性别对ISO诱导的急性心肌损伤后心脏纤维化的影响

给予FVB/N小鼠急性大剂量ISO后，运用苦味酸-天狼星红染色方法检测并未发现明显的心脏纤维化，性别对心脏纤维化也无影响(图3)。

2.4 性别对ISO诱导的急性心肌损伤后心功能的影响

LVEF与LVFS是评价心脏收缩功能的重要指标。结果显示，ISO组小鼠的LVEF与LVFS与对照组小鼠相比差异无统计学意义，雄性ISO组小鼠和雌性ISO组小鼠之间的收缩功能差异亦无统计学意义(图4A、B)。E/E′常被用来评价心脏舒张功能，实验结果显示ISO组小鼠与对照组小鼠的舒张功能差异无统计学意义，雄性ISO组小鼠与雌性ISO组小鼠的心脏舒张功能差异亦无统计学意义(图4C、D)。因此，本模型中大剂量ISO诱导的急性心肌损伤并未对心功能造成影响，性别对心功能也无明显影响。

A：胸骨旁短轴M超代表图；B：心肌细胞横截面积代表图；C：LVPW；d统计图；D：HW/TL统计图；E：HW/BW统计图；F：心肌细胞横截面积统计图；aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001图2 性别对ISO诱导的小鼠急性心肌损伤后心脏肥大的影响(n=8)

A：天狼猩红染色代表图，红色代表胶原部分；B：心脏纤维化面积统计图，组间比较差异无统计学意义图3 性别对ISO诱导的小鼠急性心肌损伤后心脏纤维化的影响(n=8)

A：LVEF统计图；B：LVFS统计图；C：E/E′统计图；D：二尖瓣血流及二尖瓣环处组织多普勒代表图；各组间比较差异无统计学意义图4 性别对ISO诱导的小鼠急性心肌损伤后心功能的影响(n=8)

3 讨论

一些临床研究提示性别是影响心血管疾病预后的因素之一[1-3]，但临床研究中都是有很多因素同时存在，其中性别因素的具体作用及机制还不清楚，仍需要大量的基础研究去探索。已有研究报道，给予慢性的ISO刺激诱导心脏重构，雌鼠心脏肥厚及纤维化的程度均低于雄鼠[8]。而不同性别在ISO诱导的急性心肌损伤中是否会有不同表现还尚无研究报道，心脏结构与功能是心脏疾病的重要评价指标，故本实验选用大剂量ISO诱导小鼠急性心肌损伤模型，进而研究性别对其心脏结构与功能的影响。

不少研究提示给予短期、大剂量ISO可导致心脏急性损伤，导致心肌细胞破裂、心脏肥厚发生[9-10]。本研究结果提示，在给予短期、大剂量ISO后，雄性小鼠心肌细胞的破裂及心脏肥厚的发生均比雌性小鼠更严重。而氧化应激是导致心脏肥厚发生的机制之一[11-12]，本研究中，雄鼠ISO组的心脏ROS生成明显高于雌鼠ISO组，这可以部分解释本研究结果中雄鼠ISO组的心脏肥厚比雌鼠ISO组严重。之前也有研究提示，雌鼠的心肌细胞更耐受氧化应激的损害[13]，这进一步支持了我们的研究结果。

但我们的实验结果也显示，性别差异对本模型中的心脏收缩功能与舒张功能没有影响，值得注意的是，本模型中给予小鼠短期、大剂量ISO后心脏收缩功能与舒张功能都没有明显变化。这提示，这个阶段心功能仍处于代偿期。另外，本模型中给予FVB/N雌雄小鼠短期、大剂量ISO也未引起明显的纤维化，而一些研究提示较长时程的ISO刺激可以引起纤维化[14-15]，结果的不同可能与给药的时程、剂量相关，也可能与实验动物种属相关[16]。

不少研究已证实，雌激素在心血管疾病中发挥着重要作用[17-18]，而ISO诱导的急性心肌损伤与β-肾上腺素受体的过度激动密切相关。也有研究提示，β-肾上腺素受体的调控与雌激素相关，长期的雌激素刺激可以减弱β-肾上腺素受体的反应[19]。因此，雌雄小鼠在ISO诱导的急性心肌损伤中的不同表现，可能与雌激素的作用相关。

利益冲突：无

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(本文编辑：谭潇)

Effects of gender on cardiac structure and function after acute myocardial injury in mice

QiaoYuhui，ZhuBaoling，LiZijian

InstituteofVascularMedicine，PekingUniversityThirdHospital；KeyLaboratoryofCardiovascularMolecularBiologyandRegulatoryPeptides，MinistryofHealth；KeyLaboratoryofMolecularCardiovascularScience，MinistryofEducation；BeijingKeyLaboratoryofCardiovascularReceptorsResearch，Beijing100191，China

Correspondingauthor：LiZijian，Email：lizijian@bjmu.edu.cn

Objective To investigate the differences of cardiac structure and function between different sexes after isoprenaline(ISO)-induced acute myocardial injury. Methods ISO(200 mg· kg-1·d-1，3 d)was injected subcutaneously to FVB/N female and male mice with the same age.The cardiac structure and function were measured by echocardiography.The activity of serum lactate dehydrogenase(LDH)and reactive oxygen species(ROS)in cardiac tissue were detected.The end-diastolic left ventricular wall thickness(LVPW；d)，the ratio of heart weight to body weight(HW/BW)，the ratio of heart weight to tibial length(HW/TL)and the area of myocardial cells were adopted as cardiac hypertrophy indexes.Cardiac fibrosis was detected by sirius red staining method. Results ISO(200 mg·kg-1·d-1，3 d)could significantly increase the activity of serum LDH and the increase was significantly higher in male mice than in female mice.Short-term administration of high-dose ISO could increase the generation of ROS in cardiac tissue sections of male mice significantly but had little effect on that of female mice.In addition，Short-term administration of high-dose ISO induced cardiac hypertrophy in female and male mice，and the degree of hypertrophy of male mice was significantly higher than that of female mice.While Short-term administration of high-dose ISO could neither induce cardiac fibrosis nor influence cardiac function in both female and male mice. Conclusions In the model of acute myocardial injury induced by ISO，the degree of cardiac hypertrophy in male mice was significantly higher than that in female mice.One reason of which may be related to ROS.There was no significant difference in cardiac function between male and female mice in this model.

Gender； Isoproterenol； Acute myocardial injury； Cardiac structure and function

李子健，电子信箱：lizijian@bjmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1007-5410.2017.02.013

国家重点基础研究发展规划项目(973)计划(2014CBA02000)；国家自然科学基金项目(81471893，81270157，81070078，91539123)

2017-02-07)