合浦珠母贝源抗氧化肽的研究进展

吴燕燕,马永凯,2,李来好,胡 晓,杨贤庆,岑剑伟

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,广东广州 510300; 2.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

合浦珠母贝源抗氧化肽的研究进展

吴燕燕1,马永凯1,2,李来好1,胡 晓1,杨贤庆1,岑剑伟1

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,广东广州 510300; 2.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

合浦珠母贝是海水养殖生产珍珠主要经济贝类,合浦珠母贝源活性肽是近年来的研究热点。本文综述了国内外近年来在合浦珠母贝源抗氧化肽的酶法制备技术、分离纯化技术、功能性质和应用的研究现状,评述了目前开发合浦珠母贝源抗氧化肽的现状及存在的问题,深入分析了现代基因工程技术在合浦珠母贝源抗氧化肽中的应用前景,为今后高效开发利用合浦珠母贝源抗氧化肽和其他海洋活性肽提供参考。

合浦珠母贝,抗氧化肽,酶法制备,分离纯化,功能性质,基因工程技术

Denham Harman在1956年提出自由基与衰老理论之后,人类开始认识到人体衰老是与体内细胞正常代谢产生的自由基有关,体内自由基可能引起各种神经衰弱疾病,比如说萎缩阿茨海默病、帕金森综合症等。正常人机体内的自由基是处于极低的水平,只有机体在特殊生理状况比如说疾病、衰老下，自由基水平才会升高,从而对机体产生危害[1]。

合浦珠母贝(Pinctadafucata)是我国海水养殖生产“南珠”的母贝,属软体动物门瓣鳃纲珍珠贝目珍珠贝科珠母贝属,主要分布在中国的广西、广东、海南海域,台湾海峡南部沿海和日本沿海一带[2]。从目前的研究来看,科研工作者对合浦珠母贝肉的研究主要集中在酶解贝肉组织蛋白获取小分子生物活性肽,这些生物活性肽的作用也很明显,比如抗氧化、抗衰老、抗菌、降压、免疫调节等[1,3-5]。近些年来随着蛋白酶解技术、分析检测技术进一步发展,越来越多的小分子活性肽从贝肉中被分离出来,但处于实验室理论研究阶段,像从贝肉中分离得到的具有清除生物体内过量自由基、抑制脂质氧化作用的小分子多肽仅可以为下一步应用到化妆品领域提供数据理论支持。结合从合浦珠母贝贝肉中分离获取的抗氧化肽生理活性和构效关系,利用化学法合成法制备抗氧化肽的技术也越来越成熟,但化学合成成本和化学合成技术的限制使得该方法也未得到广泛的应用。随着发酵生物工程、基因工程技术的发展,利用基因工程技术结合发酵生物工程制备合浦珠母贝源抗氧化肽也逐步发展起来。为此,本文综述了大宗养殖合浦珠母贝肉最近几年抗氧化肽的研究进展,以期对海洋贝类新资源的进一步开发应用开拓思路,并为后续的合浦珠母贝源抗氧化肽在化妆品、保健食品、药物开发等应用打下基础。

1 合浦珠母贝肉抗氧化肽的研究现状

1.1 合浦珠母贝肉抗氧化肽的酶解制备技术

表1 合浦珠母贝肉酶解、分离纯化活性肽

海洋生物体内的大分子蛋白质本身一般不具有生物活性,所以需要先利用已知的食用蛋白酶作用于这些蛋白质,蛋白经酶解之后分解成各个不同的具有生物活性功能的小分子肽链。具有抗氧化活性的小分子肽在自然界中广泛存在,可采用化学水解、生物发酵法、酶水解三种方法获取小分子抗氧化活性肽,但由于化学水解对蛋白肽二级结构造成破坏,生物发酵法不易控制,所以随着越来越多的蛋白酶被开发利用,酶解条件温和、酶解后活性肽安全性上更接近于天然活性肽、酶解工艺简单等原因使得酶水解方法成为近十年来人们从合浦珠母贝肉中获取抗氧化活性肽的主要途径[6-15](见表1)。常用的蛋白酶有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶等;酶解方法从一开始的单一酶解逐步完善为双酶复合酶解、多酶分步定向酶解从而达到最佳酶解效果。

从目前的研究来看,利用酶解贝肉蛋白方法制备抗氧化肽也存在着一些弊端:一是抗氧化肽的活性受到海洋新资源自身体内的氨基酸种类、含量、氨基酸排列顺序的影响较大;二是酶解大分子蛋白质后得到的酶解液中包含了不同大小的小分子肽,要得到具体某个抗氧化肽需要复杂的纯化过程,成本高,产量低,这对后期的实际生产应用有一定的限制作用;三是目前所利用的酶的种类有限,尤其对于合浦珠母贝肉的开发而言,从陆生动植物、微生物环境中得到的蛋白酶作用于它还是有一定的局限性,寻找更多种类的海洋新资源食物链环境中的蛋白酶是很有必要的。

1.2 合浦珠母贝源抗氧化肽的分离纯化技术

目前国内外对于酶解液进一步分离纯化常用技术有盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、超滤法、毛细管电泳法、凝胶过滤法、亲和层析法、疏水层析法、离子交换层析法、反相高效液相色谱法,但在合浦珠母贝源抗氧化肽制备过程常用到的分离纯化技术主要还是超滤法、凝胶过滤法、离子交换层析法和反相高效液相色谱法,如吴燕燕[1]、田倩等[16]用不同分子量的超滤膜对合浦珠母贝肉酶解液进行初分离之后,再将1～3 ku超滤组分进行葡聚糖凝胶分离,获得纯化的抗氧化肽产物。从合浦珠母贝肉中酶解制备的具有较强抗氧化活性的肽是贝肉蛋白断裂的小片段,分子量在3000 u之下,而在酶解过程中要以酸碱液调节pH,所以酶解产物中盐分含量较高,王晶等[17]在前面纯化的基础上增加了以C18柱对合浦珠母贝肉抗氧化肽的脱盐工艺技术条件,进一步提高产品的纯度。

目前,从贝肉中分离提取小分子活性肽方兴未艾,进一步优化分离提取步骤、明确构效关系、增强其稳定应用性对下一步抗氧化肽的开发应用是很有必要的。

1.3 合浦珠母贝肉抗氧化肽的功能性质

随着社会的进步,人类对健康和长寿越来越重视,从物种丰富、种类多样的海洋生物资源中寻找具有清除体内自由基的小分子抗氧化活性肽是当前的研究热点之一[18-19]。由于反应机理、氧化条件、反应时间、测定环境等因素的不同,使得不同抗氧化肽之间的抗氧化能力不同。鉴于此,一般情况下评价抗氧化肽体外抗氧化能力通常采用多种指标联合测试来阐明抗氧化肽的抗氧化能力,包括清除自由基能力(包括DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率)、抑制脂质过氧化能力、螯合金属离子的能力、协同抗氧化能力[20-21]。表1列举了目前国内研究者以合浦珠母贝肉为原料通过蛋白酶酶解制备小分子抗氧化活性肽的功能活性,这些小分子活性肽很有希望成为下一个被应用于食品领域、药品领域、化妆品领域中的活性元素。研究表明,合浦珠母贝肉抗氧化肽具有较强的抗氧化能力,DPPH自由基清除率为77.7%;超氧阴离子清除率为46.3%;羟自由基清除率为33.5%;抗亚油酸过氧化能力和抑制膜脂质过氧化能力均较强[22];并有较强的乳化性和吸油吸水保湿能力[23],而通过其对小老鼠皮肤光老化的实验则表明合浦珠母贝抗氧化肽对于延缓小鼠光老化进程有显著的作用,其在化妆品中应用将具有明显的效果[24];但在模拟胃肠道消化过程中活性保持相对较差[23],但其活性不受食盐、蔗糖等食品添加剂影响,防腐剂如0.6%的山梨酸钾和0.4%的苯甲酸钠有益于其保存,K+、Ca2+、Mg2+对其清除自由基的能力影响较小,但较高浓度的Cu2+和光照都会降低其抗氧化能力[25]。

通过酶解法获取的合浦珠母贝源抗氧化肽活性强弱一般受到肽链长度、氨基酸组成、氨基酸序列、氨基酸糖基化程度、侧链结构、分子量大小等因素的影响,吴燕燕等[26]采用基质辅助激光飞行时间质谱技术测定反相高效液相色谱分离的合浦珠母贝肉抗氧化肽的结构为Val-Ala-Thr-Gly-Leu-Arg-Lys-Glu-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Pro-Arg,其中疏水性氨基酸所占比重较大,有利于多不饱和脂肪酸自由基优先与抗氧化肽上的疏水性基团结合,与自由基链式反应形成竞争关系,所以对DPPH·具有最强清除能力。

目前关于合浦珠母贝肉抗氧化肽的构效关系研究还不是特别明朗,其影响因素对抗氧化肽构效关系的解释没有一个广泛适用的规律可归纳,还是处在不断地探索中,因此,明确其构效关系不仅对阐释生物活性肽机体内作用机理是很有必要的,也对进一步优化分离提取步骤、增强其稳定应用性很有必要的。

1.4 合浦珠母贝源抗氧化肽在食品、医药、化妆品领域的应用

随着人类步入老龄化社会,抗氧化保健食品在保健产业中所占的比重将越来越大,出于对食品安全性的考虑,化学抗氧化添加剂的应用受到限制,所以从天然产物中开发抗氧化剂是当前的研究热点。中国水产科学研究院南海水产研究所将珍珠贝肉酶解液添加到乳制品中,开发的珍珠营养奶具有提高免疫力、延缓衰老等功能[27]。吴燕燕[22]等开发的合浦珠母贝肉抗氧化肽在营养霜中应用时,实验组产品 DPPH自由基清除率为 48.34%±2.96%、羟自由基清除率为 33.52%±2.34%,抗氧化效果显著高于对照组。目前,对于合浦珠母贝肉抗氧化肽在食品、医药、化妆品领域的应用由于酶解制备一定纯度的抗氧化肽产量较低,所以在工业应用方面也存在一定的限制,基本停留在实验室理论研究阶段。但值得注意的是,从一些天然产物中分离得到的酶解蛋白粗提物已经有部分产品上市并获得巨大的经济价值和市场的广泛好评,这些成功案例都为合浦珠母贝源抗氧化肽下一步应用研究提供了理论依据和数据基础,如日本的资生堂公司和DHC公司利用从海洋生物中获得的胶原蛋白肽应用到化妆品中,提高了产品的美白、保湿、抗皱等功能,得到了市场和消费者广泛好评[28]。

2 基因工程技术在合浦珠母贝源抗氧化肽中的应用前景分析

随着分子生物学的发展和越来越多的海洋生物基因序列被破译,利用基因工程技术制备抗氧化肽已成为可能,它不仅可以实现海洋新资源的高值化、零损耗、低成本的开发利用,而且可以大幅度降低分离纯化工艺的复杂程度。上世纪80年代,美国斯坦福大学的Coken和旧金山大学的Boyer的DNA重组实验标志着基因工程的开端,随后它在蛋白应用方面飞速发展[29]。愈来愈多的酶制剂、抗菌肽等利用基因工程技术被生产出来且应用到食品领域、化妆品领域、酿酒工业领域等行业中,并显示出巨大的潜力。法国的科研人员Guillaume Mitta等在2000年从贻贝中克隆得到了防御素、贻贝素、贻贝肽等具有抗菌活性的双亲性小分子碱性多肽,这对于研究无脊椎动物来源的抗肿瘤、抗衰老、抗氧化的海洋药物具有重要的促进作用[30-31]。日本的Ryohei Sato等在2009年利用基因工程技术将来源于鲤鱼的乙酰胆碱酯酶的基因克隆导入到宿主为毕赤酵母工程菌株的表达载体中,成功表达了乙酰胆碱酯酶[32];马来西亚的Pey Yee lee等在2014年将热带假丝酵母中鲨烯合酶同样利用基因工程技术在毕赤酵母真核表达系统成功表达并纯化获得纯度约为97%的鲨烯合酶[33]。

基因工程技术被用来制备肽、大分子活性蛋白质等具有生物活性的物质经过了大概27年的发展,已经越来越完善,它正逐步成为本世纪最重要的科技进步之一,并将在创造出巨大的经济价值同时给人们的生活带来前所未有的变化。目前比较完善的基因工程表达系统主要有大肠杆菌原核表达系统和酵母菌真核表达系统,这两种表达系统由于代谢途径、诱导条件等研究的相对透彻,所以被广泛应用;其它的基因工程表达系统有杆菌等细菌原核表达系统、霉菌表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞系统、转基因动植物系统,由于这几种表达系统的机理还没有研究透彻,所以应用的相对较少[29,34-35]。与此同时,目前我国的科研人员对于利用基因工程技术开发海洋新资源抗氧化活性肽还处于起步阶段,清华大学的张岑、周玉娟[36-37]围绕着合浦珠母贝的基质蛋白的分泌的基因相关功能做了深入的研究,其中张岑利用RT-PCR和RACE扩增技术获取了编码酪氨酸酶OT47、基质蛋白KRMP家族和肌球蛋白必需轻链,初步探究了合浦珠母贝角质层的形成机制、机制蛋白的分泌机制,周玉娟在合浦珠母贝基质蛋白的研究基础之上对其启动子序列和信号通路的调控作用进行探究,研究结果为揭示合浦珠母贝中基质蛋白基因表达信号调控网络提供理论支持;暨南大学的麻建军等利用重测序、cDNA文库筛选技术对合浦珠母贝中参与自身免疫应答反应的组织蛋白酶L的全长序列,初步探讨了合浦珠母贝先天免疫调控的机制[38];上海海洋大学的李璐利用RT-PCR、cDNA末端快速扩增技术对合浦珠母贝中α-淀粉酶基因组序列进行分析和生态因子对α-淀粉酶表达影响,为探讨贝类生长的分子机制提供了理论数据支持[39]。

然而目前的研究主要围绕着海洋生物基因克隆、结构预测与分析验证等展开,对于这些从海洋生物中得到的功能基因的功能验证和在体内、体外表达变化作用规律和调控的机制还不够深入,无法明确说明基因与氨基酸、氨基酸与肽链、肽链与蛋白的关系。目前,只有马永凯、吴燕燕等[40]初步开展重组大肠杆菌制备珍珠贝源抗氧化肽的研究,发现采用这个方法确实工艺比较简单,能在较短时间内高效制备出目的蛋白,但也存在一定的问题,目前还在研发中。随着对基因工程技术的不断深入研究,基因工程载体、宿主菌株不断开发完善,利用它开发合浦珠母贝抗氧化活性肽技术路线已经越来越清晰、可操作性愈来愈强。而且现在越来越完善的转基因安全评估体系和人们对转基因安全问题认识的进一步深入为之提供了强大的法律依据和理论支持[41]。

3 展望

合浦珠母贝肉酶法制备抗氧化肽的工艺技术较成熟,合浦珠母贝肉抗氧化肽的抗氧化性质和结构以及构效关系的研究越来越多,机理也比较透彻,研究也证明其具有清除生物体内过量自由基、抑制脂质氧化作用等功能，在食品、化妆品等领域具有很好的应用前景,但由于从合浦珠母贝肉中酶法制备纯化得到的抗氧化肽产量太小,远远不能满足工业上应用的需求。一些学者也开始探讨化学法合成合浦珠母贝肉抗氧化肽,但化学合成成本高,且存在安全性问题,从而限制了该方法的使用。

基因工程技术在生物活性物质方面的应用研究已经有二十多年的经验,技术越来越完善,因此下一步结合现代生物学技术提高制备抗氧化肽的速度和纯度、明确合浦珠母贝源抗氧化肽的构效关系、降低工艺成本的实验思路和方案是具有可行性的。随着分子生物学的发展和越来越多的海洋生物基因序列被破译,利用基因工程技术制备抗氧化肽,不仅可以实现海洋新资源的高值化、零损耗、低成本的开发利用,而且可以大幅度降低分离纯化工艺的复杂程度,实现大规模制备生产合浦珠母贝源抗氧化肽,最终转化应用到食品、医药、化妆品等领域;与此同时,利用基因工程技术制备合浦珠母贝源抗氧化肽也可以有助于海洋生物资源的高值化利用,为探索氨基酸、肽、蛋白质之间的相互关系提供一种新的思路,为我国海水珍珠人工养殖产业增收,形成上游养殖、中游采珠、下游开发抗氧化肽高值化利用良好的生态产业链,对提高海水珍珠产业链在国际市场上的竞争力和影响力，以及我国开发利用其它海洋新资源具有重要的指导意义和经济价值。

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Research progress in antioxidant peptides fromPinctadafucatameat

WU Yan-yan1,MA Yong-kai1,2,LI Lai-hao1,HU Xiao1,YANG Xian-qing1,CEN Jian-wei1

(1.Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture;South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science,Guangzhou 510300,China; 2.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Pinctadafucatais the main economic shellfish in marine pearl aquaculture industry. The antioxidant peptides fromPinctadafucatahave been a research hotspot in recent years. In this paper,it was reviewed that the enzymatic preparation technology,separation and purification technology,functional properties and application research status of antioxidant peptides derived fromPinctadafucatain domestic and foreign in recent years. The development status and existing problems of antioxidant peptides derived fromPinctadafucatawere remarked. The modern genetic engineering technology in the application prospects of antioxidant peptides ofPinctadafucatawas further analyzed. It is intended to provide useful information for further efficient exploitation and utilization of antioxidant peptides ofPinctadafucataand other new marine active peptide.

Pinctadafucata;antioxidant peptides;enzymatic preparation;separation and purification;functional properties;genetic engineering techniques

2016-10-19

吴燕燕(1969-)，女，博士，研究员，研究方向：海洋产物资源利用研究与质量安全控制，E-mail：wuyygd@163.com。

广东省海洋渔业科技与产业发展专项(Z2015008)；广东省渔港建设与渔业发展专项海洋渔业科技推广方向珍珠类项目(B201601-Z07)。

TS254.5

A

1002-0306(2017)09-0381-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.065