胃促生长素对人主动脉平滑肌细胞增殖及线粒体融合蛋白2表达的影响

何永铭,宋明宝△,胡建波,张源萍,李佑美

(第三军医大学新桥医院心血管内科，重庆 400037)

胃促生长素对人主动脉平滑肌细胞增殖及线粒体融合蛋白2表达的影响

何永铭1,宋明宝1△,胡建波1,张源萍1,李佑美1

(第三军医大学新桥医院心血管内科，重庆 400037)

目的 通过体外培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，研究胃促生长素(ghrelin)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及线粒体融合蛋白2(Mfn-2)表达的影响。 方法 体外培养HASMCs，第4～6代细胞用于试验。给予不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)的ghrelin 或10-6mol/L ghrelin不同时间(0、6、12、18、24 h)处理，用四甲基偶氮唑蓝比色(MMT)法观察其对HASMC增殖的影响。RT-PCR，Western blot方法检测不同处理方法对Mfn-2表达的影响。结果 10-7～10-5mol/L的ghrelin可明显抑制HASMC增殖，浓度为10-6mol/L抑制作用最为明显 (P<0.01)。ghrelin在6～24 h内均能明显抑制HASMC增殖，在24 h达最高峰 (P<0.01)。10-6mol/L ghrelin能明显上调Mfn-2 mRNA和蛋白的表达 (P<0.01)。10-6mol/L ghrelin在18 h上调Mfn-2 mRNA和蛋白表达的作用最为明显 (P<0.01)。结论 ghrelin可能通过上调Mfn-2的表达来抑制HASMC增殖。

胃促生长素；肌，平滑，血管；主动脉；人主动脉平滑肌细胞；增殖；线粒体融合蛋白-2

血管平滑肌细胞(VSMC)增殖过度并向内膜下迁移是血管增殖性疾病的主要发病机制。胃促生长素(ghrelin)是90年代发现的生长激素促分泌素受体(GHSR)的内源性配体。研究发现，ghrelin除具有促生长激素释放功能外，还具有心脏保护功能，抑制炎症反应及炎症相关的小鼠结肠癌变[1-4]，保护血管内皮功能[5]等作用,而转录因子核转录因子kappa B(NF-κB)、Nkx2.2可调控人类ghrelin的启动子活性[6]；还有研究发现，女性外周血中ghrelin的水平与颈动脉内膜的厚度呈负相关[7-8]，推测ghrelin可能对动脉再狭窄有抑制作用。线粒体融合蛋白2(Mitofusin 2，Mfn-2)又命名为增殖抑制基因,它被发现于1997年，因能够抑制VSMC增殖而得名。Mfn-2能抑制大鼠颈动脉球囊损伤后诱导的再狭窄[9]，而Mfn-2缺陷通过干扰细胞自噬来抑制细胞增殖[10]。本文拟通过体外培养HASMCs，研究ghrelin对VSMC增殖及Mfn-2表达的影响，探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells，HASMCs)购自美国Sciencell公司。

1.1.2 试验仪器 荧光倒置显微镜(Olympus公司，美国)，凝胶成像分析系统(UVP公司，美国)，酶联免疫检测仪(Bio-Rad公司，美国)，PCR仪(Bio-Rad公司，美国)。

1.1.3 试验试剂 ghrelin(Sigma公司，美国)，胎牛血清(Sciencell公司，美国)，SMCM培养基(Sciencell公司，美国)，四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)试剂盒(江苏碧云天生物公司)；大鼠抗人Mfn-2单克隆抗体(Santa Cruz公司，美国),大鼠抗人GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国),辣根过氧化物酶标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗(江苏碧云天生物公司)；逆转录试剂盒、PCR试剂盒(TAKARA公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 HASMCs培养及试验分组 HASMCs在含20.00%胎牛血清的SMCM培养基中于37 ℃、5.00%CO2条件下培养，细胞生长达80.00%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，以1∶2比例进行传代。取第4～6代呈对数生长的HASMCs细胞接种于培养瓶中，待细胞生长至80.00%融合，无血清培养基继续培养24 h，更换为试验用液。分为空白对照组(0 mol/L ghrelin),不同浓度ghrelin组(药物终浓度分别为10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L),不同时间组(10-6mol/L ghrelin,0、6、12、18、24 h)。

1.2.2 细胞增殖活力检测(MTT法) 以5×103/孔的密度接种于96孔板内，37 ℃、5.0%CO2饱和湿度培养箱中静置培养24 h。在细胞约80.0%融合状态下，96孔板中的HASMCs换上含0.2% BSA的DMEM培养基培养24 h后，换以含0.2% BSA的含药培养基，孵育48 h后换上MTT液100 μL，继续孵育4 h，然后将培养基吸干，每孔加入200 μL二甲基亚砜，混匀后于酶标仪570 nm处测光密度(OD)值，以检测细胞的数目和活力。

1.2.3 逆转录PCR(RT-PCR)法检测Mfn-2的表达 收集处理完毕后的6孔板中的细胞，用4 ℃预冷PBS(0.01 mol/L，pH7.2～7.3)洗3遍，加入1 mL TRizol溶液裂解，按TRizol试剂盒使用说明书提取总RNA，以DNA/RNA测定仪测定RNA的浓度和纯度。将2 μL总RNA加入到20 μL体系中按逆转录合成试剂盒使用说明书合成cDNA待用。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照。Mfn-2目的片段为2 271 bp，引物序列为：5′-ATG TCC CTG CTC TTC TCT CGA TGC-3′(上游)和5′-TCT GCT GGG CTG CAG GTA CTG GT-3′(下游)；GAPDH引物序列：5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3′(上游)和5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′(下游)。PCR条件94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，共32个循环；再72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳并在紫外光下显像。

1.2.4 Western blot法检测 制作10%的分离胶和5%积层胶进行蛋白电泳，通过电转移法将蛋白转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含3%血清的TBS-T封闭1 h，分别加入3%血清的TBS-T稀释的1∶3 000鼠抗人Mfn-2单克隆抗体一抗4 ℃孵育过夜，再同结合辣根过氧化物酶的二抗孵育1 h，用化学发光试剂盒检测结果，采用GAPDH作为内参照。

2 结 果

2.1 HASMCs形态学观察 培养的第4～6代人HASMCs在显微镜下观察可见呈典型“峰-谷”状生长。细胞形体多呈长梭形，核大，可见明显的肌丝纤维，见图1。

A:典型“峰-谷”状生长(×40);B:细胞形体多呈长梭形、核大(×100)。

图1 HASMCs形态学观察

2.2 ghrelin对HASMC增殖的影响 与空白对照组相比，ghrelin在10-7～10-5mol/L浓度范围内均可抑制HASMC增殖，其中以10-6mol/L ghrelin抑制增殖的作用最为明显，10-6mol/L ghrelin组与空白对照组OD值比较：(45.74±4.78)%vs.(91.48±6.85)%，差异有统计学意义(P<0.01)。与0 h组相比，ghrelin在6～24 h均可抑制HASMC增殖，24 h达到高峰[36.22±0.81)%vs.(57.28±0.99)%，P<0.01]，见图2。

A:不同浓度ghrelin对HASMC的增殖作用；B：不同时间ghrelin(10-6mol/L)对HASMC的增殖作用。*：P<0.05，与0 mol/L比较。#：P<0.05，与10-6mol/L组比较;△:P<0.05，与0 h比较。

图2 ghrelin对HASMC增殖的影响

2.3 ghrelin对Mfn-2 mRNA表达的影响 对照组Mfn-2 mRNA为1.0。10-7～10-5mol/L的ghrelin均能明显上调Mfn-2 mRNA的表达(10-7、10-6、10-5mol/L ghrelin 分别为：2.44±0.55、2.70±0.45和2.71±0.46，P<0.05)。10-6mol/L ghrelin在12～24 h内能明显上调Mfn-2 mRNA的表达，18 h达最高峰(4.48±1.57，P<0.01)，但在6 h，ghrelin对Mfn-2 mRNA的表达无明显影响(P>0.05)，见图3。

A:不同浓度ghrelin对Mfn-2 mRNA的作用；B：不同时间ghrelin对Mfn-2 mRNA的作用。*：P<0.05，与0 mol/L比较。#：P<0.05，与10-6mol/L组比较;△:P<0.05，与0 h比较。

图3 ghrelin对Mfn-2 mRNA表达的影响

A:不同浓度ghrelin对Mfn-2蛋白的作用；B：不同时间ghrelin对Mfn-2蛋白的作用。*：P<0.05，与0 mol/L比较;#:P<0.05，与0 h比较。

图4 ghrelin对Mfn-2蛋白表达的影响

2.4 ghrelin对Mfn-2蛋白表达的影响 对照组Mfn-2 蛋白为1.0。10-8～10-5mol/L浓度的ghrelin均能上调Mfn-2蛋白的表达，在10-6mol/L ghrelin达最高峰(2.46±0.11，P<0.01)。而10-9mol/L浓度的ghrelin对Mfn-2蛋白表达无影响(P>0.05)。ghrelin在12～24 h内能明显上调Mfn-2蛋白的表达，18 h达最高峰(2.18±0.03，P<0.01)。而18 h和24 h之间蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

3 讨 论

动脉粥样硬化、高血压、支架内再狭窄等血管增殖性疾病的发病率逐年增加。目前已证实，VSMC增殖-凋亡失衡是此类疾病的主要特征。抑制VSMC增殖，有望成为预防和治疗血管增殖性疾病新的方法。

ghrelin是1999年Kojima等[11]发现的一种可促进生长激素释放的酰化肽。近年研究发现，ghrelin具有广泛的生理作用，且与心血管疾病、免疫炎症反应、糖尿病、肿瘤等密切相关。研究认为ghrelin是一个心脏保护因子，可以抑制血管内皮细胞凋亡，促进血管内皮细胞的增殖[12]，具有血管内皮保护功能，但对血管平滑肌的作用目前仍不清楚。本研究结果显示， ghrelin能抑制HASMC增殖且能促进血管内皮细胞的增殖，推测其对动脉再狭窄有抑制作用。

Mfn-2是具有抑制VSMC增殖功能的基因，参与血管平滑肌细胞分化，有望成为血管增殖性疾病干预的新靶点[13]。研究发现，在大鼠颈动脉球囊损伤再狭窄模型上，适度上调Mfn-2的表达可以明显抑制VSMC增殖，抑制率分别为97.2%和82.0%[14]，Mfn-2在控制细胞增殖中起重要作用。

本课题组发现在HASMCs，ghrelin上调Mfn-2 mRNA和蛋白的表达和其抑制HASMC增殖的作用在浓度和时间上基本上是一致的，也就是说ghrelin在上调Mfn-2的表达的同时能明显抑制HASMC增殖。这提示，ghrelin可能通过上调Mfn-2的表达来抑制HASMC增殖。进一步探讨ghrelin在心血管疾病发病过程中的作用及机制，可为心血管疾病的防治提供新的靶点。

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Effect of ghrelin on proliferation and mitofusin-2 expression of human aortic smooth muscle cells

HeYongming1,SongMingbao1△,HuJianbo1,ZhangYuanping1,LiYoumei1

(DepartmentofCardiology,XinqiaoHospitalofThirdMedicalMilitaryUniversity,Chongqing400037,China)

Objective To investigate the effects of ghrelin on proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) and the expression of mitochondrial fusion 2 (Mfn-2) in cultured human aortic smooth muscle cells (HASMCs).Methods HASMCs were cultured in vitro，treated with different concentrations(10-9，10-8，10-7，10-6，10-5mol/L)ghrelin or 10-6mol/L ghrelin for different time(0，6，12，18，24 h).Subconfluent HASMCs at passage 4-6 were used in experiments.MTT essay was used to investigate the effect on proliferation of HASMCs.RT-PCR and Western blot were used to analyse the expression of Mfn-2.Results 10-7-10-5mol/L ghrelin inhibited the proliferation of HASMCs,and the inhibitory effect of concentration of 10-6mol/L was the most obvious(P<0.01).Ghrelin inhibited the proliferation of HASMCs in 6-24 h，and it reached the peak at 24 h(P<0.01).10-6mol/L ghrelin significantly increased the expression of Mfn-2 mRNA and protein(P<0.01).The up-regulation of 10-6mol/L ghrelin on Mfn-2 mRNA and protein expression reached the peak at 18 h(P<0.01).Conclusion Ghrelin might inhibit the proliferation of HASMC by up-regulating the expression of Mfn-2.

ghrelin；muscle,smooth,vascular；aorta;human aortic smooth muscle cells；proliferation;mitofusin 2

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.006

何永铭(1976-)，主治医师，本科，主要从事冠心病临床与基础方面研究。△

,E-mail：smb0939@163.com。

R543.1

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1671-8348(2017)15-2034-03

2016-11-26

2017-01-14)