胶束电动色谱在线富集检测苯氧酸除草剂残留

陈冠华，洪月琴，梅晓芸，邹雪梅，周佳伟

(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)



胶束电动色谱在线富集检测苯氧酸除草剂残留

陈冠华，洪月琴，梅晓芸，邹雪梅，周佳伟

(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

为检测粮食样品中苯氧酸除草剂残留，建立了一种采用极性转换大体积进样方式的胶束电动毛细管色谱新方法.研究了缓冲液、进样时间、分离和富集电压对分离和富集的影响，优化的缓冲液由20 mmol/L磷酸盐和60 mmol/L SDS组成，pH为7.5；分离和富集电压分别为20 kV和-20 kV；进样量为3.5 kPa×200 s.最佳条件下4种除草剂的富集倍数为510～620，方法检出限为0.20～0.38 μg/kg，粮食样品的加标回收率80.6%～96.7%.方法可用于粮食样品中苯氧酸除草剂残留的检测.

苯氧酸除草剂；极性转换；在线富集；胶束电动色谱

自20世纪40年代合成出2,4-D以来，陆续有多种苯氧酸类除草剂相继得到开发和应用.该类除草剂具有快速、广谱和价廉等优点，已被广泛用于大宗粮食作物的除草作业中.违规施用可使其残留进入作物的可食部分，进入人体后将会导致性激素比例失衡，影响人体内正常的生理生化反应.许多国家和地区都规定了此类除草剂在食品中的最大残留限量(MRL)，欧盟规定小麦中毒莠定的MRL为0.05 mg/kg.

已报道的苯氧酸除草剂检测方法主要有气相色谱(GC)[1-2]、气相色谱-质谱(GC-MS)[3-4]、高效液相色谱(HPLC)[5-6]、液相色谱-质谱(LC-MS)[7-8]等.这些色谱类的方法都具有检测能力较强的特点，但是由于该类除草剂挥发性差，采用GC和GC-MS方法检测都需要进行衍生化处理；为了防止对色谱系统的污染，采用HPLC和LC-MS方法检测前通常要采用固相萃取等手段对样品进行净化处理，在利用反相色谱分离时还需要使用离子对试剂.

毛细管电泳(CE)适合于这类有机酸类化合物分离检测，然而由于CE的进样量极低，限制了其在农药残留检测中的应用，已报道的CE检测苯氧酸除草剂残留的方法多采用了离线富集辅助手段[9-10].离线富集耗时，富集倍数有限.在线富集采用大体积进样后的反向推扫，可将样品塞中的溶剂自毛细管入口推出，分析物同时得到充分浓缩，而后续的分离过程不会因样品塞较大影响到分析物的分离.本文将建立的方法用于粮食中的苯氧酸除草剂残留的检测.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

P/ACE MDQ毛细管电泳仪(Beckman Coulter公司)；未涂层石英毛细管(邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司)，内径75 μm，总长60 cm，有效柱长50 cm；BS 124S 电子分析天平(赛多利斯公司)；B5500S-MT 超声清洗机(上海必能信超声有限公司)；pHS-2 型酸度计(上海第二分析仪器厂)；WH-2微型漩涡混匀仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；恒温水浴振荡器(江苏金坛市中坛仪器厂)；HH-S8数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；索式抽提器(华东器化玻)；WK-1000A高速药物粉碎机(青州市精诚机械有限公司)；均质机(南京以马内利仪器设备有限公司)；RE-2000 旋转蒸发仪(上海亚荣生化学仪器厂).

乙腈、甲醇、丙酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、氯化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)均为分析纯，购于上海国药化学试剂有限公司.2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D,95%)购于湖北远成赛创科技有限公司；4-氯苯氧异丁酸(体积分数98%)，购于上海思域化工科技有限公司；二氯吡啶酸(体积分数99%)、毒莠定(体积分数99%)购于利尔化学；大米、面粉、燕麦片购于镇江市旅游超市；实验用水为去离子水，电阻率为182 kΩ·m.

1.2 样品和标准溶液的制备

称取粉碎(面粉除外)至149 μm目的样品5×4.0000 g，分置于5个50 mL聚四氟乙烯(PTFE)离心管中，分别加入15 mL乙腈-水(2∶1,体积比)、2.5 g氯化钠，均质5 min后于恒温水浴振荡器中振摇30 min.取上清液，向残渣中再各加入15 mL乙腈-水(2∶1,体积比)重复上述操作，合并上清液于分液漏斗中振摇3 min，静置后收集乙腈层于40 ℃下旋蒸至干，然后用少量乙腈溶解，以20 mmol/L磷酸盐缓冲液定容至1 mL待用.

精密称取的一定量的2,4-D、4-氯苯氧异丁酸、毒莠定、二氯吡啶酸分别溶解于少量乙腈中，用20 mmol/L磷酸盐缓冲液定容至1 mL，获得质量浓度为5～200 μg/kg的标准溶液系列.

1.3 电泳条件

运行缓冲液含20 mmol/L磷酸盐，60 mmol/L SDS，pH为7.5；以3.5 kPa压力进样200 s；富集电压为-20 kV，当电流恢复至分离电流的95%时，电压转为20 kV，开始分离；分离温度为25 ℃；检测波长为210 nm.

新毛细管使用前依次用甲醇、水、1 mol/L HCl、水、1 mol/L NaOH、水活化5 min.每天实验前依次用0.1 mol/L NaOH、水、运行缓冲液洗10 min平衡毛细管.2次运行间依次用0.1 mol/L NaOH、水、运行缓冲液对毛细管平衡3 min.

2 结果

2.1 缓冲液参数的优化

缓冲液pH可通过影响管壁与分析物的电荷而影响分析物的迁移行为，电解质浓度则可通过影响EOF对分离产生影响.在pH 6.5～8.5、磷酸盐浓度10～35 mmol/L内的考察结果表明，在该pH范围内，其取值不影响分析物的基线分离，但磷酸盐浓度低于20 mmol/L时2,4-D和4-氯苯氧异丁酸有部分重叠，在20～35 mmol/L内都可基线分离；各苯氧酸除草剂的迁移时间则是在pH7.5时均最小，而随磷酸盐浓度的增加，迁移时间均逐步增加.综合考虑，选择pH7.5和20 mmol/L作为最优的pH和磷酸盐浓度.

实验结果表明，SDS胶束的加入可有效改善4种除草剂的峰形，由于峰宽的减小而使其峰高增加.在20～100 mmol/L内的考察结果显示，在20～60 mmol/L内各除草剂峰高随SDS浓度增大而增加，超过60 mmol/L时，峰高基本不变.因此，选择60 mmol/L为最佳SDS浓度.

2.2 分离电压的确定

分离电压可影响分离效率和迁移时间.在15～25 kV内的实验结果表明，迁移时间随电压升高而缩短，但基线噪声亦会随之增加.在20 kV下各除草剂均有较快分析速度和较大峰高，最终选定分离电压为20 kV.

2.3 进样时间的选择

进样量和压缩后的样品区带长度均可受到进样时间的影响，分离度和富集效果因此会受到影响.以3.5 kPa分别进样不同时间，以-20 kV电压将注入的样品反推至进样端后用上述优化条件分离，结果如图1所示.各除草剂峰高随进样时间的加大而增加，在超过200 s后，各峰均出现一定程度的展宽，并且2,4-D和4-氯苯氧异丁酸出现部分重叠，故进样时间以200 s为宜.

2.4 反向富集电压的影响

在上述优化的进样和分离条件下，在-15～-25 kV内考察了反向富集电压各除草剂峰面积的影响.结果表明，在-15～-20 kV，各峰面积基本不变；在-20 kV以外，各峰面积随电压数值增加而下降.此外，在考察范围内，随反向电压数值下降，各除草剂出峰时间逐渐推后.综合考虑，-20 kV被确定为最优的富集电压.

2.5 富集倍数

以优化的方法分离质量浓度均为0.01 mg/L的4种除草剂混合标准溶液，测得其各自峰面积为Si；以3.5 kPa×3 s的进样量注射质量浓度为30 mg/L的4种除草剂混合标准溶液，在相同分离条件测得各自的峰面积为si；富集倍数fi=(Si/si)/(30/0.01).由此计算出2,4-D、4-氯苯氧异丁酸、毒莠定、二氯吡啶酸的富集倍数分别为620、531、569、510.

2.6 工作曲线和方法参数

在最佳条件下分析了空白样品溶液和标准溶液系列，4种苯氧酸除草剂在5～200 μg/kg内呈现良好的线性关系.在1 d内重复5次测定50 μg/kg的标准溶液，在3 d内分别重复测定同样浓度的标准溶液，所得RSD分别为日内精密度和日间精密度.标准曲线、线性动态范围(LDR)、3S/N的检出限(LOD)、日内和日间精密度如表1所示.

表1 工作曲线,线性范围,检出限和精密度Tab.1 Calibration curves,LDRs,LODs and precisions

2.7 样品及加标回收率的测定

对市售大米、面粉和燕麦片进行了测定，均未检出苯氧酸除草剂残留.为检验方法的准确性，对3种粮食样品分别进行了4种除草剂的加标回收率测定，结果如表2所示.大米样品和50 μg/kg加标大米样品的电泳图如图2所示.加标回收率测定结果表明，方法可满足中国、美国、欧盟、日本等规定的苯氧酸除草剂MRL要求，可用于粮食中苯氧酸除草剂残留的测定.

1. 2,4-D；2. 4-氯苯氧异丁酸；3. 毒莠定；4. 二氯吡啶酸.图1 进样时间的影响Fig.1 Effect of injection time

1. 2，4-D；2. 4-氯苯氧异丁酸；3. 毒莠定；4. 二氯吡啶酸.图2 大米(a)和加标大米(b)电泳Fig.2 Electropherography of rice (a) and spkied rice (b)

表2 加标样品回收率

3 讨论

4种苯氧酸除草剂在运行缓冲液条件下均带负电荷.在极性转换大体积样品推扫毛细管电泳法中，样品被尽可能多地注入毛细管中，然后在毛细管两端施加反向电压，带负电的分析物在电场作用下电泳方向朝向检测端，但其速率小于电渗流(EOF)，合成运动朝向进样端.同时，在EOF的作用下样品塞中溶剂被朝向进样端的EOF逐步推出毛细管.当电流示值为正常分离电流的95%时，表明样品区带中的溶剂已基本被排出毛细管，分析物则在样品区与缓冲液区界面处被胶束推扫而聚集，实现了在线富集.此时电压转向，对分析物进行分离检测.该富集方法能在保证正常分离的情况下，使毛细管中容纳的样品量大大增加，有效改善了浓度检出限，其分离过程相当于以正常小体积进样方式将浓缩了的样品注入毛细管后的普通分离模式.加标样品的电泳图充分展示了本方法优势，并展现了其在粮食样品检测中的应用潜力.

[1] SANTOS-DELGADO M J,CRESPO-CORRAL E,POLO-DEZ L M.Determination of herbicides in soil samples by gas chromatography:optimization by the simplex method[J].Talanta,2000,53(2):367-377.DOI:10.1016/S0039-9140(00)00498- 7.

[2] VINK M,VAN DER POLL J.Gas chromatographic determination of acid herbicides in surface water samples with electron-capture detection and mass spectrometric confirmation[J].Journal of Chromatography A,1996,733(1):361-366.DOI:10.1016/0021-9673(95)00997-3.

[3] SARAJI M,FARAJMAND B.Application of single-drop microextraction combined with in-microvial derivatization for determination of acidic herbicides in water samples by gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2008,1178(1):17-23.DOI:10.1016/j.chroma.2007.11.056.

[4] SCHEYER A,MORVILLE S,MIRABEL P,et al.A multiresidue method using ion-trap gas chromatography-tandem mass spectrometry with or without derivatisation with pentafluorobenzylbromide for the analysis of pesticides in the atmosphere[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2005,381(6):1226-1233.DOI:10.1007/s00216-005-3060-4.

[5] HU J,YANG T,YIN S,et al.Dissipation and residue of MCPA (4-chloro-2-ethylphenoxyacetate) in wheat and soil[J].Environmental Monitoring and Assessment,2012,184(8):5017-5024.DOI:10.1007/s10661- 011-2317-y.

[6] 杨素萍，郭振福，刘敏，等.功能化离子液体/离子液体分散液-液微萃取测定水中苯氧羧酸类除草剂[J].分析化学，2015，43(6)：904-908.DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.150020. YANG S P，GUO Z F，LIU M，et al.Functionalized ionic liquid / ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction for determination of phenoxy acid herbicides in water samples [J].Chinese Journal of Analytical Chemistry，2015，43(6)：904-908.DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.150020.

[7] SANTILIO A,STEFANELLI P,GIROLIMETTI S,et al.Determination of acidic herbicides in cereals by QuEChERS extraction and LC/MS/MS[J].Journal of Environmental Science and Health,Part B,2011,46(6):535-543.DOI:10.1080/03601234.2011.583876.

[8] 于彦彬，张嵘，李莉，等.固相萃取液相色谱-串联质谱法测定土壤中9种苯氧羧酸类除草剂残留量[J].分析化学，2014，42(9)：1354-1358.DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.140128. YU Y B，ZHANG R，LI L，et al.Determination of 9 phenoxy acid herbicides in soil by solid phase extraction and LC/MS/MS [J].Chinese Journal of Analytical Chemistry，2014，42(9)：1354-1358.DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.140128.

[9] TABANI H,FAKHARI A R,ZAND E.Low-voltage electromembrane extraction combined with cyclodextrin modified capillary electrophoresis for the determination of phenoxy acid herbicides in environmental samples[J].Analytical Methods,2013,5(6):1548-1555.DOI:10.1039/c3ay26252a.

[10] SHAKULASHVILI N,REVIA R,STEINER F,et al.Simultaneous determination of various classes of pesticides using micellar electrokinetic capillary chromatographyin combination with solid-phase Extraction[J].Chromatographia,2004,60(3-4):145-150.DOI:10.1365/s10337-004-0350-5.

(责任编辑：梁俊红)

Detection of phenoxy acid herbicide residues by micellar electrokinetic chromatography with online preconcentration

CHEN Guanhua,HONG Yueqin,MEI Xiaoyun,ZOU Xuemei,ZHOU Jiawei
(College of Food and Bioengineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

A new micellar electrokinetic capillary chromatography with polarity switching and large sample size was developed to determine phenoxy acid herbicides remained in cereals.The effects of buffer,injection time,separation and enrichment voltage on separation and preconcentration were studied.The optimum buffer was 20 mmol/L phosphate and 60 mmol/L SDS at pH7.5.The separation and enrichment voltages were 20 kV and -20 kV.Sample size was 3.5 kPa×200 s.The enrichment factors were 510-620 and limits of detection 0.20-0.38 μg/kg.The recoveries of spiked cereals were 80.6%-96.7%.The assay can be applied to detect phenoxy acid herbicides remained in cereals.

phenoxy acid herbicide;polarity switching;online enrichment;micellar electrokinetic chromatography

2016-08-20

江苏省自然科学基金资助项目(BK20151338 )；江苏高校优势学科建设工程资助项目

陈冠华(1956- )，男，山西万荣人，江苏大学教授，博士生导师，主要从事食品安全检测研究. E-mail: chengh@ujs.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.03.004

O657.8

A

1000-1565(2017)03-0243-05