RSUME、HIF-1α小泛素化与侵袭性垂体腺瘤相关性☆

涂伟杨越陈真黄玲沈晓黎祝新根

·论 著·

RSUME、HIF-1α小泛素化与侵袭性垂体腺瘤相关性☆

涂伟*杨越*陈真*黄玲*沈晓黎*祝新根*

目的 研究RWD结构小泛素化增强子（RWD containing sumoylation enhancer，RSUME）增强小泛素化分子（small ubiquitin related modifiers，SUMO）竞争性抑制泛素蛋白B（ubiquitin B，UBB）对缺氧诱导因子1α （hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α）的降解作用与侵袭性垂体腺瘤的相关性。方法 采用免疫组化、qPCR检测38例非侵袭性垂体腺瘤、38例侵袭性垂体腺瘤以及10例正常垂体包膜中RSUME、SUMO-1、UBB、HIF-1α在蛋白质和mRNA两个水平上的表达，并进行比较，并采用western blot检测HIF-1α及其小泛素化及泛素化情况，并分析不同类型垂体腺瘤中HIF-1α的SUMO-1表达的差异。结果 侵袭性垂体腺瘤中RSUME、HIF-1α的mRNA以及HIF-1α的SUMO化水平明显高于非侵袭性垂体腺瘤及正常垂体组织（P＜0.01）；非侵袭垂体腺瘤中RSUME、HIF-1α的mRNA以及HIF-1α的SUMO化水平均高于正常垂体组织（P＜0.01），而侵袭性垂体腺瘤中HIF-1α的泛素化明显低于非侵袭性垂体腺瘤及正常垂体组织（P＜0.01），非侵袭垂体腺瘤中HIF-1α的泛素化低于正常垂体组织（P＜0.01）。不同类型的垂体腺瘤中HIF-1α的SUMO化的表达没有明显差异（P＞0.05）。结论 RSUME可能通过增强HIF-1α的SUMO化的作用竞争性抑制泛素化与垂体腺瘤血管的新生及肿瘤的侵袭相关。

RWD结构小泛素化增强子 小泛素化分子 缺氧诱导因子 侵袭性垂体腺瘤

垂体腺瘤可分为功能型垂体腺瘤及无功能型垂体腺瘤，部分垂体腺瘤可向周围组织结构侵袭被定义为侵袭性垂体腺瘤，侵袭性垂体腺瘤是介于非侵袭性垂体腺瘤及垂体癌之间的过渡型，侵袭型垂体腺瘤具有较高的浸润性及复发率。目前已知侵袭性垂体腺瘤的发生与血管新生密切相关。泛素化可促进肿瘤侵袭因子如缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α）的降解，但RWD结构小泛素化增强子（RWD containing sumoylation enhancer，RSUME）可通过增强小泛素化分子 1 （small ubiquitin related modifiers，SUMO）的表达竞争性抑制泛素化蛋白B（ubiquitin B，UBB）对HIF-1α的降解作用，促进肿瘤血管新生，然而其侵袭的分子学机制尚不明确[1]。本研究收集了2013年1月至2014年12月垂体腺瘤标本76例，研究RSUME、SUMO-1、UBB、HIF-1α在侵袭性垂体腺瘤中的表达，并探讨其与垂体腺瘤侵袭的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 纳入标准[2]：①既往无垂体手术史；②近期无激素服用；③无重大的基础疾病史 （无心、肝及肺等重要脏器疾患，肝肾功能正常）；④MRI提示垂体腺瘤，术前激素水平、术后病理报告证实为垂体腺瘤。纳入南昌大学第二附属医院2013年1月至2014年 12月垂体腺瘤样本 76例。依据侵袭性垂体腺瘤的判断标准：①结合术前MRI检查依据Hardy-Wilson分类法Ⅳ级以上或Knosp分类法Ⅲ级或Ⅳ级；②术中见垂体腺瘤侵袭周围组织结构；③术后HE染色符合侵袭性垂体腺瘤。其中侵袭性垂体腺瘤（侵袭组）和非侵袭性垂体腺瘤（非侵袭组）各38例，其中男32例，女44例，年龄28～70岁，平均（50±12）岁，见表1。垂体腺瘤标本依据Hardy-Wilson分类法及Knosp分类法分为侵袭组及非侵袭组，各标本分为三部分，一部分甲醛固定用于免疫组化；一部分放置RNA保存液，后转入-80℃冰箱，行qPCR实验；一部分保存至-80℃冰箱行western blot检测。对照组：垂体囊肿切除术得到的正常垂体包膜10例。纳入标准：①既往无垂体（鞍区）手术史；②近期无激素服用；③无重大的基础疾病史（无心、肝及肺等重要脏器疾患，肝肾功能正常；④MRI检查提示为垂体囊肿。

1.2 荧光定量PCR检测RSUME、HIF-1α基因表达水平 取适量新鲜垂体腺瘤组织与1mL总RNA抽提试剂用组织均浆器混匀，并按步骤加入氯仿、异丙醇、无水乙醇提取总RNA；按逆转录试剂盒说明书进行逆转录，得到cDNA；配制PCR反应液：2μL cDNA，上下游引物各1μL（引物：选择表达稳定的脑膜瘤β-actin作参照物，引物由上海生物工程公司合成。RSUME上游引物：5＇-TACCTGGTATCTCGATTAACTCTGAAC-3＇，下游引物：5＇-TCAGTATTATTTTACCCATGAACATCA-3＇，扩增片段 348 bp；HIF-1α上游引物：5＇-CATAGAACAGACAGAAAAATCTCATCC-3＇，下游引物：5＇-TTAACTTGATCCAAAGCTCTGAGTAAT-3＇，扩增片段450 bp；β-actin上游引物：5＇-ACGGGGTCACCCACACTGTGC-3＇，下游引物：5＇-CTAGAAG CATTTGCGGTGGACGAT G-3＇，扩增片段659 bp）。SYBR○Premix Ex TaqTMⅡ10μL，添加去离子水使总体积达到20 μL。进行Real Time PCR反应：第一步，95℃预变性30 s；第二步，95℃5 s，60℃30 s循环40次。根据公式 ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin和ΔΔCt=ΔCt处理组-ΔCt对照组统计结果，结果以 2-ΔΔCt表示，相对表达值为1。

1.3 免疫组化 取甲醛固定的垂体腺瘤组织，石蜡包埋，3%H2O2阻断过氧化物酶活性10min，PBS冲洗3次，5%胎牛血清孵育20min，分别加入兔抗人SUMO-1（Anbo Biotechnology Company）、HIF-1α抗体4℃过夜孵化，PBS再次冲洗3次；加入生物素酰化二抗，孵育2h，PBS冲洗3次；加入辣根过氧化物酶标记生物素孵育2h，DAB显色。阴性对照组（一抗处加入PBS）。封片拍照后采用美国Media Cybernetic公司设计的Image-Pro-Plus 6.0图像分析软件，测5个视野的积分吸光度（integral optical density，IOD）值及图片去除空白的面积，两者相比即可得出该图片的平均IOD值，以此作为免疫反应强度指标。

半定量分析，其结果均由副教授以上专业人士判定。表达判定方法：随机选择4个高倍视野（×400倍），根据染色细胞数及染色强度进行半定量分析，将染色结果分为阴性、弱阳性、阳性、强阳性。评分方法：①根据染色强度评分，阴性0分，弱阳性1分，阳性2分，强阳性3分；②根据染色细胞数评分[3]，阴性表达0分，染色细胞数＜10%计1分，10%~50%计2分，＞50%计3分。根据染色强度与阳性细胞数的乘积：0~2分（-），3~4分（+），5~7（++），8~9（+++）。

1.4 蛋白印迹法检测SUMO-1、UBB、HIF-1α蛋白的表达水平 取新鲜垂体腺瘤组织按照总蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白，利用生物分光光度计比色分析总蛋白含量。80mV电压下在10% SDS-PAGE电泳2 h。PVDF膜在250mA下转膜30min～80min。5%脱脂奶粉封闭液中室温下封闭2 h或4℃过夜封闭，TBST洗膜3次。分别加入目的蛋白一抗 （兔抗人SUMO-1、UBB多克隆抗体Anbo Biotechnology Company；兔抗人HIF-1α多克隆抗体 cell signaling technology，均已 1：1000稀释）、β-actin(1∶5000稀释)一抗，4℃过夜孵育；洗膜3次后加入二抗(1∶5000稀释)。依据ECL化学发光试剂盒操作说明进行显影、定影。利用凝胶图像分析系统对胶片进行灰度扫描和净光密度值分析。结果以目的蛋白/内参的IOD比值表示。

1.5 统计学方法 使用SPSS19.0进行统计分析。各组间数据的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法，计量数据均以均数±标准差（±s）表示，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 垂体腺瘤中SUMO-1、HIF-1α蛋白表达及定位情况 免疫组化如图1所示：SUMO-1蛋白非侵袭组（A）及侵袭组（B）的阳性着色主要定位分布于垂体腺瘤细胞胞浆中。HIF-1α蛋白非侵袭组（C）及侵袭组（D）的阳性着色主要定位分布于垂体腺瘤细胞胞浆或（和）细胞核中。侵袭性垂体腺瘤中SUMO-1较非侵袭性垂体腺瘤明显增多（表2，χ2=13.689，P=0.034），并且侵袭性垂体腺瘤中HIF-1α表达较非侵袭性垂体腺瘤明显增多 （表2，χ2=14.678，P=0.023）。

图1 不同级别垂体腺瘤组织中SUMO-1、HIF-1α免疫组织化学染色结果(×400)。A：非侵袭性垂体腺瘤SUMO-1染色；B：侵袭性垂体腺瘤SUMO-1染色；C：非侵袭性垂体腺瘤HIF-1α染色；D：侵袭性垂体腺瘤HIF-1α染色

表1 垂体腺瘤与患者临床病理特征的关系

2.2 垂体腺瘤中RSUME、HIF-1α基因表达水平

qPCR检测 RSUME、HIF-1α的 mRNA水平，RSUME、HIF-1α在侵袭性垂体腺瘤中mRNA表达明显增加（表3，F=145.605，F=597.222，P＜0.01）。

2.3 垂体腺瘤中SUMO-HIF-1α、UBB-HIF-1α蛋白的表达水平Western blot检测正常组、非侵袭组及侵袭组的蛋白表达水平，与正常组及非侵袭组相比，侵袭性组中SUMO-HIF-1α蛋白表达明显增加（图2，表3，F=33.835，P＜0.01），而侵袭性垂体腺瘤中UBB-HIF-1α蛋白明显低于非侵袭性垂体腺瘤及正常垂体组织 （表3，F=32.470，P＜0.01）。

2.4 垂体腺瘤中SUMO-HIF-1α蛋白的表达水平

依据患者垂体腺瘤的类型分类，根据单因素方差分析示各组之间SUMO-HIF-1α蛋白的表达存在差异性（图3，表4，F=3.319，P=0.011）。通过SNK组间两两比较发现生长激素型垂体腺瘤组、泌乳素型垂体腺瘤组、促肾上腺皮质激素型垂体腺瘤组、甲状腺激素型垂体腺瘤组以及无功能型垂体腺瘤组之间的SUMO-HIF-1α的表达水平均无明显差异性（P＞0.05），但其SUMO-HIF-1α的蛋白表达均高于对照组（表4，P＜0.01）。

3 讨论

KIM等[4]研究表明，HIF-1的高表达影响侵袭性垂体腺瘤的生长。低氧条件下HIF-1为广泛存在于人体中的一种二聚体转录因子，HIF-1由HIF-1α和HIF-1β亚基组成[3]，其功能的发挥主要依赖HIF-1α的作用。HIF-1α参与人体的生长、发育以及一些病理反应，为肿瘤代谢、血管新生及转移的重要因子。血管新生为侵袭性垂体腺瘤生长的主要因素，血管新生依赖血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的作用，而HIF-1为VEGF的上游因子。常氧环境下HIF-1α蛋白很快会被降解，但由于肿瘤生长旺盛，常处于缺氧状态，因此垂体腺瘤中HIF-1α具有较高表达，并且HIF-1α可随着垂体腺瘤侵袭性的增加而表达增强 （图1，表2，χ2=14.678，P= 0.023）。通过肿瘤不断的生长及血管的新生，正常供血难已维持肿瘤生长的需求，此时肿瘤会诱导HIF-1α的表达，以代偿肿瘤的缺氧状态。同时HIF-1α也可通过调控下游靶基因VEGF进一步促进血管新生，增强肿瘤侵袭性。本研究证实：侵袭性垂体腺瘤中HIF-1α蛋白及mRNA的表达均高于非侵袭性垂体腺瘤及正常垂体组织（图1，P= 0.02，表3，F=597.22，P＜0.01）,提示HIF-1α可能与垂体腺瘤的侵袭性相关。然而泛素化-蛋白酶体的泛素化作用可迅速将 HIF-1α降解[5]，因此HIF-1α与垂体腺瘤侵袭作用的机制并不完全，HIF-1α的作用需要RSUME介导的SUMO化的修饰竞争型抑制泛素化[6]。

表2 SUMO-1、HIF-1α免疫组织化学半定量分析结果

表3 SUMO-HIF-1α、UBB-HIF-1α的蛋白水平以及RSUME、HIF-1α的mRNA表达水平

泛素分子（UBB）具有标记靶蛋白，诱导靶蛋白降解的作用，常氧状态下HIF-1α会被其标记，并迅速降解。SUMO分子与UBB具有相似的蛋白结构，却具有相反的作用，且两者之间存在竞争性抑制。SUMO拥有三种蛋白亚型，其主要作用亚型为SUMO-1[7]，SUMO-1可竞争性抑制泛素化阻断蛋白质的泛素化-蛋白酶体降解途径，增加HIF-1α的稳定性，SUMO化的作用首先需要SUMO-1分子被泛素活化酶E1激活，形成成熟的SUMO-1蛋白，然后与泛素结合酶E2（Ubc9）结合，最后用泛素连接酶E3与靶蛋白结合增强底物蛋白质的稳定性及活性[8]。本研究证实在HIF-1α泛素化位点的修饰中，随着SUMO分子表达的增强，UBB分子的表达也相应下降（图2，表3，F=32.470，P＜0.01）。这可能与HIF-1α序列中的泛素化位点Lys391和Lys477的SUMO化竞争性抑制泛素化并阻断蛋白质的泛素化-蛋白酶体降解途径相关[9-10]。

图2 垂体腺瘤组织中SUMO-HIF-1α、UBB-HIF-1α的蛋白表达。I：对照组;II：非侵袭组;III：侵袭组

RWD结构蛋白由RSUME编码的195个氨基酸组成，其结构与泛素结合酶 E2（Ubc9）相似[11]。人体较多组织中均可检测到RSUME的表达，特别是在垂体组织中具有较高的表达；CARBIANAGASHIMA等[6]学者认为RSUME被证实具有促进肿瘤侵袭的能力，其作用机制可能是由RSUME通过SUMO化促进肿瘤血管新生[12-13]，从而促进肿瘤的侵袭。SUMO化的作用需要泛素活化酶E1、泛素结合酶E2以及泛素连接酶E3共同作用[14]。人体中缺少泛素结合酶E2，RSUME可编码RWD结构蛋白，通过替代E2酶的作用，促进HIF-1α 的SUMO化，从而在侵袭性垂体腺瘤的增殖以及血管新生发挥重要作用[15-17]。本研究证实在侵袭性垂体腺瘤中的SUMO-1以及RSUME的表达均高于非侵袭性垂体腺瘤及正常垂体组织（图1，P= 0.009，表 3，F=145.61，P＜0.05）。LI[5]等学者认为SUMO化作用于HIF-1α转录后的水平，与mRNA的表达并不相关；但FOWKES[12]等学者认为随着垂体腺瘤侵袭性的增强，RSUME及HIF-1α的mRNA水平也会增加，本研究的结果与FOWKES等的研究结果一致,提示RSUME有可能通过增强HIF-1α的SUMO化的作用促进垂体腺瘤的侵袭性，HIF-1α稳定表达可为侵袭性垂体腺瘤的生长、侵袭提供更好条件。同时实验证明RSUME相关的SUMO-1的表达可能促进垂体腺瘤的发生（表4，F=3.319，P=0.011），但与垂体腺瘤发生的类型无明显关系。

RSUME作为侵袭性垂体腺瘤发病机制研究中发现的一个新的基因，其能通过增强人体垂体腺瘤中HIF-1α的SUMO化作用，促进垂体腺瘤血管新生及肿瘤侵袭，RSUME作为侵袭性垂体腺瘤研究的一个新的靶点，对其更加深入的研究，将给侵袭性垂体腺瘤的防治研究提供一个新的思路。

表4 SUMO-HIF-1α的蛋白水平

图3 不同类型垂体腺瘤组织中SUMO-HIF-1α的蛋白表达水平

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The relationship between RSUME and small ubiquitin related modifiers of HIF-1α with invasive pituitaryadenomas.

TU Wei,YANG Yue,CHEN Zhen,HUANG Ling,SHEN Xiaoli,ZHU Xingen.Department of Neurosurgery, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,Jiangxi province,330006,China.Tel:0791-86311396.

Objective AIM:To study whether the RWD containing sumoylation enhancer（RSUME)enhanced small ubiquitin related modifiers (SUMO)to competitively inhibit Ubiquitin B (UBB)-mediated degradation of hypoxia hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α)and the invasive pituitary adenomas.Methods The expression of protein and mRNA levels of RSUME,SUMO-1,UBB and HIF-1α were detected by using immunohistochemistry,western blot and qPCR in 38 cases of non-invasive pituitary adenoma,38 cases of invasive pituitary adenomas and 10 cases of normal pituitary capsule.The expression of SUMO-1 was analyzed in different types of pituitary adenomas.Results The protein,and mRNA levels of RSUME,SUMO-HIF-1αwere significantly higher in the invasive pituitary adenomas than in the non-invasive pituitary adenomas and normal pituitary capsule(P<0.01).The protein and mRNA levels of RSUME, SUMO-HIF-1αwas higher in non-invasive pituitary adenomas than in normal pituitary capsule(P<0.01).However,theprotein levels of UBB-HIF-1α were significantly lower in the invasive pituitary adenomas than in the non-invasive pituitary adenomas and normal pituitary capsule(P<0.01).The protein of UBB-HIF-1α were lower in non-invasive pituitary adenomas than in normal pituitary capsule(P<0.01).The expression levels of SUMO were not significantly different among different types of pituitary adenomas(P>0.05).Conclusion RSUM may increase pituitary adenomas angiogenesis and promote tumor invasion through enhancement of SUMO of HIF-1α which competitively inhibits ubiquitination of HIF-1α.

RSUME SUMO HIF-1α Invasive pituitary adenomas

R733

A

2016-11-09）

（责任编辑：甘章平）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.03.008

☆江西省自然科学基金（编号：20142BAB205032）；江西省教育厅科学基金（编号：14064）；江西省科技厅科技支撑计划（编号：20133BBG70072）；国家自然科学基金（编号：30760258）资助

* 南昌大学第二附属医院神经外科（南昌330006）

通信作者（E-mail:shenxldoc@126.com）