有机消泡剂对棘孢木霉菌株Tr148c液体发酵分生孢子产量的影响

马晓梅,王 军,2,旷文丰,褚 凯,陈 晨 ,毛伟力*

(1.上海万力华生物科技有限公司，上海 201203；2.安徽农业大学，安徽 合肥 230036)

有机消泡剂对棘孢木霉菌株Tr148c液体发酵分生孢子产量的影响

马晓梅1,王 军1,2,旷文丰1,褚 凯1,陈 晨1,毛伟力1*

(1.上海万力华生物科技有限公司，上海 201203；2.安徽农业大学，安徽 合肥 230036)

为了筛选对发酵液中棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株Tr148c的分生孢子产量无副作用的消泡剂，在PDA培养基中分别加入0.1%、0.4%和0.7%的10种消泡剂。其中天然油脂(豆油)、聚醚类(GPE-6330，GP-6301)和有机硅类(L-101a，L-104a)对菌株Tr148c的生长抑制率都显著低于其它消泡剂(P≤0.05)。将筛选出的5种消泡剂进行消泡测试，发现GPE-6330、L-101a和L-104a在消泡和抑泡能力上都分别显著优于豆油和GP-6301(P≤0.05)。考察了GPE-6330、L-101a和L-104a的用量及对菌株Tr148c产孢量的影响。在相同条件下，当L-101a对发酵液的消泡和抑泡效果达到生产工艺要求时，其用量以及对菌株Tr148c分生孢子产量的影响都显著优于GPE-6330和L-104a(P≤0.05)。

木霉菌；有机消泡剂；液体发酵；消泡能力

木霉菌(Trichodermaspp.)是一种已广泛应用于蔬菜、水果和花卉等多种经济作物上的生防微生物，具有竞争、重寄生、抗生、诱导抗性和促进生长等多种功能，在作物病害生物防治中起到了重要作用[1-2]。木霉菌孢子制剂是目前应用在农业生产中的一种主要形式[3]。如何获得大量的木霉菌孢子，是制备木霉菌孢子制剂的关键[4]。虽然深层液体发酵技术为木霉菌孢子产业化生产带来了可能性，但在液体发酵过程中，由于通气、搅拌、菌液黏稠度逐渐加大以及培养基中代谢产物积累等原因，发酵液会产生大量的泡沫[5]。当泡沫超过一定范围时，极易造成发酵液漫罐、杂菌污染或必须降低装料系数等不利影响[6]。张路军等[7]采用有效的消泡剂，可使谷氨酸发酵生产设备利用率达90%。因此，对发酵过程中所产生的泡沫加以控制，是一项必要的技术措施。

目前液体发酵工业生产所采用的消泡方法有物理消泡法(如机械搅拌、静电、冷冻、高速离心、加/减压和超声波[8])和化学消泡法。添加化学消泡剂经济方便，而且消泡效果好，在液体发酵工业生产中得到了广泛应用[9]。发酵工业常用的化学消泡剂有4类，分别是油脂、聚醚、有机硅和聚醚改性硅氧烷[10]。不同的化学消泡剂对微生物菌体生长的影响不同，它们可能会降低或抑制发酵微生物的生长和产量。李刚等[11]发现消泡剂磷酸三丁酯对光合细菌生长的抑制作用极为显著。崔耀军[5]发现消泡剂LB-625不仅对BAA中温ɑ-淀粉酶发酵液体的消泡、抑泡作用明显，而且对菌体生长无抑制作用，从而提高了发酵液的放罐体积和酶产量。

有机消泡剂已经广泛应用于医药、造纸和农药等多种行业的发酵生产中[12-15]。但有机消泡剂应用于棘孢木霉菌分生孢子发酵生产的报道还很少。作者通过比较多种消泡剂在发酵过程中对棘孢木霉菌株Tr148c生长的影响和对泡沫的控制能力，筛选出适合菌株Tr148c深层液体发酵生产分生孢子的消泡剂，拟为工业化生产木霉菌孢子制剂和稳定产品质量提供参考。

1 实验

1.1 菌种、培养基及试剂

棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株Tr148c，由上海万力华生物科技有限公司从采自安徽合肥的土壤样品中筛选获得，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC No：5201)。

PDA培养基：在200 g去皮土豆中加入500 mL水，煮沸20 min，过滤，上清液中加葡萄糖20 g、琼脂粉20 g，充分混匀，定容至1 L。分装到1 L三角瓶中，装液量500 mL，1×105Pa下灭菌20 min，冷却至50 ℃，无菌条件下倒入培养皿，冷却后备用。

发酵培养基：在200 g去皮土豆中加入适量的水，煮沸20 min，过滤，上清液中加甘露醇30 g·L-1、酵母粉1 g·L-1，充分溶解，定容至1 L。装液量为150/500 mL[4]，1×105Pa下灭菌20 min，冷却后备用。

消泡剂：豆油(天然油脂)，GPE-6330、GP-6301、GP-6303(聚醚类)，T-30c(高碳醇)，L-101a、L-104a、TSA-673(有机硅类)，LX-601、LX-603(聚醚改性聚硅氧烷类)，市售。

1.2 方法

1.2.1 斜面菌种培养

向250 mL茄瓶中加入80 mL PDA培养基，1×105Pa下灭菌20 min。斜面静置冷却后，在无菌条件下接种菌株Tr148c，并放入28 ℃培养箱中培养10 d，然后放置在4 ℃冰箱中保存备用[10]。

1.2.2 种子液的制备

在无菌条件下，刮取茄瓶中斜面生长的菌株Tr148c分生孢子，用无菌水配成5×107个·mL-1的分生孢子悬浮液(用血球计数法统计分生孢子数目)，即得种子液。

1.2.3 发酵液的制备

将150 mL发酵培养基加入到500 mL三角瓶中，1×105Pa下灭菌30 min，冷却至室温。按4%的接种量将种子液在无菌条件下转接入三角瓶中，初始发酵液的孢子量为2×106个·mL-1，于转速为200 r·min-1、28 ℃下发酵144 h[4]，即得发酵液。

1.2.4 消泡剂对菌株Tr148c生长抑制率的测定

分别将每种消泡剂按0.1%、0.4%、0.7%的用量添加到PDA培养基中混匀，以不加消泡剂的PDA培养基作为空白对照。1×105Pa下灭菌30 min，冷却至50 ℃，在无菌条件下倒入培养皿中，待PDA培养基冷却凝固后，用灭菌打孔器取直径为5 mm的Tr148c菌体块，分别接种于不同处理的平皿中央。每个处理3个平行，将平皿置于28 ℃培养箱中培养3 d。采用SPSS软件，Duncan′s Multiple Range Test统计学方法分析，显著性差异 (P≤ 0.05,n=3)统计各种消泡剂对菌株Tr148c生长的影响(相同字母表示无显著性差异)，按下式计算生长抑制率：

式中：D0为空白对照Tr148c菌丝生长半径；D为经消泡剂处理的Tr148c菌丝生长半径。

1.2.5 消泡剂的消泡和抑泡能力的测定

消泡能力：在1 000 mL量筒中加入200 mL已发酵48 h的发酵液作为起泡液，以5 L·min-1的恒定速率通入空气鼓泡，当泡沫高度达到量筒800 mL的位置时，迅速加入0.02%的消泡剂，同时用秒表记录泡沫完全消失的时间。消泡时间短，即消泡剂的消泡能力强[9]。

抑泡能力：向1 000 mL量筒中加入200 mL上述发酵液、0.02%的消泡剂，搅拌均匀后以5 L·min-1的恒定速率通入空气鼓泡，记录10 min内泡沫的生成量。泡沫生成量少，即消泡剂的抑泡能力强[9]。

1.2.6 消泡剂用量及其对菌株Tr148c产孢量的影响

将筛选出的消泡剂在10 L发酵罐中进行用量(泡沫控制能力)及对菌株Tr148c产孢量影响的测试：在9个10 L发酵罐中，分别装入6.5 L发酵培养液，加入0.1%筛选出的消泡剂(每种消泡剂做3个平行，随机排列)，1×105Pa下灭菌20 min，冷却至室温，在无菌条件下加入4%的种子液，初始培养液的孢子量为2×106个·mL-1；同时将发酵罐在温度28 ℃、通气量5.8 L·min-1、搅拌速度250 r·min-1下培养144 h。用发酵罐中的消泡电极测定泡沫液位，以超过罐体80%为临界点。每个发酵罐配备10%的消泡剂，当发酵罐中的泡沫液位超过罐体80%时，自动流加消泡剂。分别在发酵60 h、84 h和108 h时记录消泡剂用量，测定孢子量。

将筛选出的综合性能最好的消泡剂，用以上相同的测试方法在2个750 L发酵罐中进行重复性验证实验。发酵罐在温度28 ℃、通气量250 L·min-1、搅拌速度150 r·min-1下培养144 h。每个发酵罐配备10%的消泡剂，消泡剂用量的记录和孢子量的测定同上。

2 结果与讨论

2.1 消泡剂对菌株Tr148c生长的影响(图1)

由图1可以看出，当消泡剂用量为0.1%和0.4%时，GP-6303、T-30c、LX-601和LX-603对菌株Tr148c的生长抑制率都超过了30%，T-30c甚至超过了60%，显著高于其它消泡剂对菌株Tr148c的生长抑制率(P≤0.05)；当消泡剂用量为0.7%时，GP-6303、T-30c、LX-601、LX-603和TSA-673对菌株Tr148c的生长抑制率分别为98.1%、67.76%、84.22%、71.76%和23.89%，显著高于其它消泡剂对菌株Tr148c的生长抑制率(P≤0.05)；当消泡剂用量为0.1%时，GP-6301对菌株Tr148c的生长有一定的促进作用，当用量为0.4%和0.7%时，对菌株Tr148c的生长有一定的抑制作用。豆油、GPE-6330、L-101a和L-104a在任何用量下，对菌株Tr148c的生长不仅没有抑制作用，相反有一定的促进作用。特别是豆油，随着用量的增加，促生长作用不断增强。因此，选择豆油、GPE-6330、GP-6301、L-101a、L-104a进行消泡和抑泡能力的测定。

图1 消泡剂对菌株Tr148c生长的影响

2.2 消泡剂的消泡和抑泡能力的测定结果(表1)

表1 消泡剂的消泡和抑泡能力的测定结果

Tab.1 Determination results of anti-foaming and foam- suppressing capabilities with defoaming agents

由表1可以看出，GPE-6330消泡能力显著优于豆油和GP-6301(P≤0.05)。虽然L-101a、L-104a和GP-6301的消泡时间之间无显著性差异，但它们都显著少于豆油所用的消泡时间(P≤0.05)。同时GPE-6330、L-101a和L-104a的抑泡能力显著优于GP-6301和豆油(P≤0.05)。因此，选择GPE-6330、L-101a和L-104a进行10 L发酵罐实验。

2.3 消泡剂的用量及其对菌株Tr148c产孢量的影响测定结果

在10 L发酵罐中进行菌株Tr148c的发酵实验，消泡剂的用量及其对菌株Tr148c产孢量的影响见图2。

图2 消泡剂的用量(a)及其对菌株Tr148c产孢量(b)的影响

由图2a可以看出，菌株Tr148c在10 L罐的发酵过程中，消泡剂L-101a、L-104a和GPE-6330的用量都随着发酵时间的延长而增加，其中GPE-6330在发酵至84 h和108 h时的用量(145.2 mL、378.6 mL)都显著少于L-104a的用量(170.6 mL、435.4 mL)(P≤0.05)，但显著高于L-101a的用量(81.7 mL、173.4 mL)(P≤0.05)。

由图2b可以看出，虽然菌株Tr148c的产孢量在所测试的3种消泡剂中，都随着发酵时间的延长而增多，但当发酵时间达到84 h和108 h时，加入了L-101a的菌株Tr148c的产孢量(1.75×108个·mL-1、2.25×108个·mL-1)都显著高于加入了L-104a的产孢量(0.95×108个·mL-1、1.45×108个·mL-1)和GPE-6330的产孢量(1.25×108个·mL-1、1.65×108个·mL-1)(P≤0.05)。表明，L-101a在10 L发酵罐中，不仅具有良好的消泡、抑泡作用，同时对菌株Tr148c的菌丝生长及产孢的影响最小。因此，选用L-101a在750 L发酵罐中进行重复性验证实验。

在符合工艺要求条件下，菌株Tr148c在750 L发酵罐中进行了两批次发酵，最终产孢量分别为2.3×108个·mL-1和2.4×108个·mL-1，有机消泡剂L-101a用量分别为11.0 L和10.5 L，达到了测试的预期要求。

2.4 讨论

虽然多种有机消泡剂已广泛应用于发酵工业，但不同的发酵产品以及不同的发酵生产工艺所要求的有机消泡剂是不同的。朱文浩等[16]筛选了6种不同的有机消泡剂，测试它们对发酵液的消泡、抑泡能力，开发出了一种应用在糖蜜酒精发酵中的高效消泡剂。胡廷等[17]对4种有机消泡剂进行了筛选，选择了一种有机硅消泡剂，应用在味精发酵生产中。

目前，国内外在消泡剂的性能测试方面尚无统一的方法和标准。优良的消泡剂不但具有消泡效率高、经济成本低、安全无毒等特点[18]，同时还应具备在发酵过程中不引起发酵产物代谢异常、符合发酵生产的工艺要求、不影响产量并有利于发酵产物的后续处理等特征[5]。刘跃等[9]和魏浩等[19]根据消泡剂的消泡、抑泡能力以及它们对菌体生长和发酵物产量的影响，筛选出一种最佳消泡剂。由此可见，当选用的消泡剂与发酵物相容，同时还具有较好的消泡能力时，能提高发酵物的产量。本实验选用有机硅类消泡剂L-101a用于棘孢木霉菌株Tr148c的液体发酵，用量少且对菌株的生长和分生孢子产量有促进作用。

3 结论

通过平板测试对10种消泡剂与棘孢木霉菌株Tr148c的相容性进行筛选，初筛出5种消泡剂进行消泡、抑泡能力测定，进而筛选出3种消泡剂GPE-6330、L-101a、L-104a进行10 L发酵罐实验，考察了消泡剂用量及其对菌株Tr148c产孢量的影响，最终筛选出了L-101a作为菌株Tr148c液体发酵的最佳消泡剂。作为一种有机硅消泡剂，L-101a不仅与菌株Tr148c相容性好，在液体发酵过程中的用量少且消泡、抑泡能力显著，同时对菌株Tr148c菌体生长和分生孢子的产量具有促进作用。

本研究初探了有机消泡剂在木霉菌发酵生产中的应用，为消泡剂进一步应用于木霉菌孢子制剂产业化生产提供了参考。

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Effect of Organic Defoaming Agent on Conidial Spore Production ofTrichodermaasperellumTr148c in Liquid Fermentation Process

MA Xiao-mei1，WANG Jun1,2，KUANG Wen-feng1，CHU Kai1，CHEN Chen1,MAO Wei-li1*

(1.ShanghaiW.L.H.Bio-techCo.，Shanghai201203,China；2.AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036,China)

InordertoscreenadefoamingagentusedintheliquidfermentationprocesswhichhadnosideeffectsonconidialsporeproductionofTrichoderma asperellumstrainTr148c，0.1%，0.4%，0.7%ofeachof10defoamingagentswererespectivelyaddedintoPDAculturemedium.ThegrowthinhibitoryratesofstrainTr148cweresignificantlylower(P≤0.05)inthetreatmentswiththedefoamingagentsofnaturaloil(soybeanoil)，polyether(GPE-6330，GP-6301)andorganicsilicon(L-101a，L-104a)comparedtotheothers.Defoamingtestswith5selectedagentswereconducted，andtheresultsshowedthattheanti-foamingandfoam-suppressingcapabilitiesofGPE-6330，L-101aandL-104aweresignificantlybetter(P≤0.05)comparedtotheothers.ThedosagesofGPE-6330，L-101aandL-104a，andeffectsofthemontheconidialsporeproductionofstrainTr148cwereinvestigated.Whenanti-foamingandfoam-suppressingeffectsmetthetechnicalrequirementsunderthesameconditions，thedosageofL-101aduringthefermentationprocesswassignificantlyless(P≤0.05)andhadnosideeffectsonconidialsporeproductionofstrainTr148ccomparedtothosewithGPE-6330andL-104a，respectively.

Trichodermaspp.;organicdefoamingagent;liquidfermentation;defoamingability

国家科技型中小企业技术创新项目(14C26213100929)

2016-10-13

马晓梅(1987-)，女，黑龙江绥化人，硕士研究生，研究方向：微生物学，E-mail：759948123@qq.com；

毛伟力，博士，E-mail：weilimao@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.03.010

TQ458

A

1672-5425(2017)03-0040-05

马晓梅,王军,旷文丰,等.有机消泡剂对棘孢木霉菌株Tr148c液体发酵分生孢子产量的影响[J].化学与生物工程，2017，34(3)：40-44.