响应面法优化两歧双歧杆菌益生元类冻干保护剂

陈合，齐康儒*，李轶超，刘誉，胡曼，吴玉喜

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安710021；2.陕西和氏乳品有限公司，陕西宝鸡721003）

响应面法优化两歧双歧杆菌益生元类冻干保护剂

陈合1，齐康儒1*，李轶超2，刘誉2，胡曼1，吴玉喜1

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安710021；2.陕西和氏乳品有限公司，陕西宝鸡721003）

以两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）为试验菌株，以冻干存活率为评价指标，采用中心组合试验设计对两歧双歧杆菌益生元类冻干保护剂进行优化。结果显示，益生元类冻干保护剂的优化配方为菊糖13%，水苏糖11%，低聚木糖7%，经重复试验验证后的冻干存活率是（88.7±1.3）%，与预测值无显著性差异（P＞0.05），这说明采用响应面法优化两歧双歧杆菌冻干保护剂是可行的。关键词：益生元；两歧双歧杆菌；冷冻干燥；冻干保护剂；优化

CHEN He1,QI Kangru1*,LI Yichao2,LIU Yu2,HU Man1,WU Yuxi1
(1.School of Food and Biological Engineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an 710021,China; 2.Shaanxi Heshi Dairy Co.,Ltd.,Baoji 721003,China)

近几年，我国将益生菌广泛应用到食品中，特别是在发酵乳品中占有很大的比重，如奶酪、酸奶、面包、饮料、冰激凌等，益生菌可以促进人体健康[1-3]。两歧双歧杆菌的保健功能已日益明确，它可以治疗慢性腹泻和伪膜性肠炎、保护肝脏、提高人体肠道内钙、磷、铁的利用率等，该菌在药物生产和食品开发相继推出并日渐普及。然而由于两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）属专性厌氧菌，且对营养要求严格、低pH条件下抵抗力差以及不耐氧性，所以该菌在保藏过程中很容易失活[4]。工业生产过程可以显著改变微生物的结构和功能特性，在临床试验或食品生产中使用益生菌都需要稳定的生产方式[5-6]。一些研究表明，微生物在经过适当干燥后在室温下长期储存存活[7]，而冻干型的微生态制剂则能最大程度上保持菌体的活性[8]。

目前，通常利用真空冷冻干燥技术对菌种进行保藏，冻干保护剂的添加可减少由于各种物理化学原因造成的细胞损伤从而降低细胞死亡率[9]，在冷冻干燥过程中的水的去除导致细胞组件结构不完整，使细胞功能损失或减值[10]，目前冷冻过程中细胞损伤的机理主要被认为有溶质效应和机械效应。干燥过程中细胞内的水分被快速蒸发导致局部过干，从而破坏细胞的水膜保护层，损害细胞活性。因不同保护剂具有不同的特性，一般情况下多种类型保护剂按一定配方混合使用可明显提高保护效果，研究表明，10%或20%多糖与10%脱脂牛奶混合制作的保护剂对双歧杆菌MYL16具有最优良的保护效果[11]，碳水化合物对益生菌有保护作用[12]，如海藻糖的玻璃化转变温度显著提高了细胞的玻璃态转变温度，从而使细胞在胞外未结冰的情况下达到玻璃相。据报道山梨醇[13]、蔗糖、乳糖[14-15]、甘露糖、菊粉、低聚果糖[16]、氨基酸等和碳水化合物具有相同的效果，同时菊芋还具有增值益生菌的能力[17]。糖作为冻干保护剂通过形成氢键增强细胞在干燥过程中的脱水耐性，这有助于在缺水的情况下维持细胞中大分子的结构[18]，从而抵消冷冻干燥过程中产生的负面影响。另外，由于糖的玻璃化温度较高，在干燥过程中仍能在蛋白质分子附近形成玻璃态，维持蛋白质分子结构的稳定从而起到保护作用[19]。曹永梅等[20]对双歧杆菌保护剂进行了优化，发现以蔗糖、脱脂奶粉、甘油按一定比例复配后的保护效果较佳。甘油能在过冷状态下进入细胞中平衡渗透压从而减少脱水对细胞造成的伤害，糖则形成高黏度的玻璃态降低了扩散系数，通过阻断大分子的运动降低其渗透性[21]。各种保护剂保护机理不同，保护剂可作填充剂、作为防冻剂、抗氧化剂、酸碱调节剂、缓冲剂等有效降低细胞的死亡率。

以益生元作为冻干保护剂的产品对机体健康有积极的作用，在前期工作中主要利用单因素试验分别探究了菊糖、低聚半乳糖、低聚果糖、水苏糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖等作为冻干保护剂对两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）的保护效果，结果发现不同浓度的益生元对两歧双歧杆菌的保护效果存在差异，而且添加单一的保护剂后其冻干存活率低[22]。为提高冻干菌粉的存活率，避免菌粉在长期保藏中活菌数快速减少，保证菌粉的质量满足商业生产的需求，本研究在前期试验基础上，运用响应面分析法中心组合试验设计对益生元类冻干保护剂配比进一步优化，适宜的冻干保护剂对两歧双歧杆菌的应用、质量和保藏至关重要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BB01：食品与生物工程学院研究室保存。

MRS培养基和MRS肉汤培养基：北京陆桥技术股份有限公司。

低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、菊糖、低聚异麦芽糖、水苏糖：北京嘉康源科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

PSH-3C pH计：上海阔思电子有限公司；DH5000AB型微生物培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；XSZ-4G型显微镜：重庆光学仪器厂；DSX-280B手提式式蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；GT16-Φ型高速台式离心机：北京时代北利离心机有限公司；LGJ-15D型冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的培养与冻干操作流程

菌种活化→接种MRS肉汤培养基→37℃厌氧培养16～24 h→6 000 r/min、低温离心15 min→不同保护剂溶液与湿菌体按2∶1（mL∶g）混合均匀→以0.75 cm的高度分装到冻干管→-20℃预冻10～12 h→冷冻干燥16～18 h→密封保藏。

1.3.2 活菌计数

冷冻浓缩物于磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution，PBS）缓冲液中10倍梯度稀释，采用平板计数法，厌氧37℃培养48 h，分别对冻干前后两歧双歧杆菌活菌计数并计算冻干存活率，公式如下：

1.3.3 数据分析

试验与数据利用SAS（Version，9.1.3）及Design-Expert. 8.05b统计软件进行设计拟合模型并分析。

2 结果与分析

2.1 响应面法优化益生元类冻干保护剂

依据前期试验，选出低聚木糖（X1）、菊糖（X2）、水苏糖（X3）三个主要影响因子，而后根据最陡爬坡试验及其试验结果得到菊糖，低聚木糖和水苏糖分别以含量为13%，7%和11%作为随后的响应面中心组合试验中心点。以两歧双歧杆菌冻干存活率（Y1）作为响应值，采用MRS肉汤培养基培养菌种后，离心得到的菌泥除添加不同配比的冻干保护剂外其余质量比以磷酸缓冲液作为基础冻干保护剂来补齐，两歧双歧杆菌益生元类冻干保护剂选用3因素5水平（N=23）的响应面试验因素与水平见表1，结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 中心组合设计因素与水平Table 1 Factors and levels of central composite design

表2 中心组合设计试验结果Table 2 Results of central composite design experiments

利用统计分析软件对表2的试验结果建立回归模型并进行数据分析，得到以下回归模型方程：

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根据表3方差分析结果可知，回归方程的F值（26.0224）＞F0.01（9，10）=4.94，表明方程描述X1、X2、X3与Y1之间存在显著的线性关系，同时也说明这种实验方法是有效的。表中方程平方项X12、X22、X32的P值均＜0.001，表明保护因子与菌存活率之间并不是简单的线性关系。交互项的F值为5.828 617，表明X1、X2、X3彼此间有一定的相互影响。表3中失拟项的F值是0.027 733且P值为0.993 273表明该方程可以对实验进行拟和且实验误差小，所以该回归方程可用于响应面法优化益生元类冻干保护剂的配比。

不同保护剂因子对冻干存活率大小的影响及走势变化结果见图1。由图1可知，响应值Y1随X1和X2变化明显，说明了响应值Y1受X1、X2因子的影响非常大，并且极值都在拐点处出现。其中，冻干存活率Y1先随着X1的增大而增大，当最大值在中心点出现以后，Y1则随着X1的增加而逐渐减小，X2对Y1的影响与X1类似，这可能是因为初始添加益生元量太少不能完全取代细胞周围失去的水分子，当其量过高时又会产生渗透压使细胞快速失水导致细胞结构损坏。图1中的Y1值随保护因子X3添加量的增大反而逐渐减小，一直呈下降趋势，水苏糖具有增值两歧双歧杆菌的能力培养后可明显提高活菌数，这也是图1中Y1＞1的原因，同样地它也具有结合自由水的能力，一定程度上可以保护细胞在冷冻干燥中形成大量冰晶造成的破坏，但也会使细胞中的自由水大量流失而失去保温性，在快速冷冻中细胞可能难以维持原有的结构特性。

图1 存活率随因子变化趋势Fig.1 Change trends of survival rates with factors

利用Design-Expert.8.05b分析软件对X1、X2、X3交互作用进行分析，结果分别见图2。

图2 低聚木糖、菊糖、水苏糖交互作用对冻干存活率影响的响应面及等高线Fig.2 Response surface plots and contour line of effect of interaction between xylooligosaccharide,inulin and stachyose on freezeing survival rate

由图2A可知，等高线形状是一个近似圆形的椭圆，说明两歧双歧杆菌冻干存活率与菊糖和低聚木糖存在相互交叉影响但作用较弱，也就是说选择X1与X2合适的配比可提高响应值Y1的大小，但这并不能显著提高菌的存活率。

由图2B可知，等高线形状是一个鞍马形图，说明两歧双歧杆菌冻干存活率受低聚木糖和水苏糖相互交叉影响非常显著。

由图2C可知，等高线形状与图2B类似，表明菊糖和水苏糖与两歧双歧杆菌冻干存活率之间具有相互交叉的影响且效果非常明显，所以选择X1与X3，X2与X3之间合适的配比有利于显著提高菌存活率。

通过SAS软件回归分析得到X1、X2、X3三因子的极大值点，即低聚木糖、菊糖和水苏糖含量分别为7%、13%、11%，在该条件下预测得到的两歧双歧杆菌冻干存活率是89.2%，低聚木糖、菊糖、水苏糖三者之间相互协调，通过弥补活性大分子周围失去的水分子而具有保护剂的功效。2.2验证实验

两歧双歧杆菌BB01在接种量为5%，37℃培养18 h，6000r/min离心15min去上清液后收集菌泥，对照组只添加PBS缓冲液作为保护剂，实验组则是添加优化后的益生元类作为保护剂，分别作3组平行实验，实验值以三者平均数为准，最终得到实验组的冻干存活率是（88.7±1.3）%，接近预测值，表明用响应面法优化两歧双歧杆菌益生元类冻干保护剂是有效可行的，冻干菌粉存活率在一定程度上显著提高。

3 结论

利用响应面中心组合实验得到了两歧双歧杆菌益生元类冻干保护剂的优化配方，优化后配方为：菊糖含量为13%，水苏糖含量为11%，低聚木糖含量为7%。在此条件下，双歧杆菌的冻干存活率为（88.7±1.3）%。结果证明响应面法用于优化两歧双歧杆菌冻干保护剂是有效可行的，在一定程度上提高了两歧双歧杆菌的冻干存活率，同时得到了活性较高的冻干菌粉，适宜的冻干保护剂对于应用两歧双歧杆菌、稳定活菌产品品质和长期储存具有一定意义。

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TS201.3

0254-5071（2017）05-0081-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.017

2016-12-19

陕西省科技统筹创新工程计划项目（2016KTCL02-30）

陈合（1956-），男，教授，硕士，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：齐康儒（1992-），男，硕士研究生，研究方向为发酵工程。