Genistein对大鼠卵巢颗粒细胞CYP19表达的影响

温海霞+孟毅++杨永斌+殷立维++张若瞳

[摘要] 目的 觀察大豆异黄酮主要活性成分金雀异黄素（Genistein）对大鼠卵巢颗粒细胞CYP19表达的影响，探讨可能的分子机制。 方法 选择25～28日龄的雌性大鼠21只，采用孕马血清促性腺激素（PMSG）皮下注射法建立促卵泡发育模型，分离颗粒细胞进行培养。实验分为0、0.1、1、5、10、100 μmol/L Genistein组、17β-E2（10 nmol/L）组、雌激素受体（ER）-α阻断剂Tamoxifen（1 μmol/L）预处理30 min后加Genistein（1和10 μmol/L）组，空白对照组即0 μmol/L Genistein组。各组细胞处理48 h后，采用RT-PCR法检测CYP19及其上游调控基因肝受体类似物（LRH-1）mRNA的表达。 结果 1、5和10 μmol/L Genistein组CYP19和LRH-1mRNA的表达高于空白对照组（P < 0.05）；而100 μmol/L Genistein组CYP19和LRH-1 mRNA的表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。与10 μmol/L Genistein相比，Tamoxifen（1 μmol/L）预处理细胞30 min后再加入10 μmol/L Genistein组LRH-1 mRNA的表达明显下降（P < 0.05），而CYP19 mRNA的表达则未受Tamoxifen的影响（P > 0.05）。 结论 1、5和10 μmol/L Genistein可明显上调大鼠卵巢颗粒细胞CYP19和LRH-1 mRNA表达，但这种促进作用可能并非通过ER-α介导。

[关键词] 大豆异黄酮；Genistein；卵巢颗粒细胞；CYP19；LRH-1

[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（b）-0020-04

Effects of Genistein on the CYP19 expression in rat ovarian granulosa cells

WEN Haixia1 MENG Yi2 YANG Yongbin1 YIN Liwei1 ZHANG Ruotong1

1.Department of Physiology， Harbin Medical University， Heilongjiang Province， Harbin 150081， China； 2.Heilongjiang Nursing College， Heilongjiang Province， Harbin 150086， China

[Abstract] Objective To investigate the effects and molecular mechanism of Genistein， which is a major active component for soy isoflavones， on the CYP19 expression in the rat ovarian granulosa cells. Methods 21 female rats， 25-28 day-old， were injected subcutaneously with pregnant mare serum gonadotrophin （PMSG）， ovarian granulosa cells were collected， incubated and treated with Genistein （0， 0.1， 1， 5， 10， 100 μmol/L）， 17β-E2 （10 nmol/L）， and Genistein （1， 10 μmol/L） with estrogen receptor-α （ER-α） blocker Tamoxifen （1 μmol/L） pretreated for 30 min. Control group was 0 μmol/L Genistein group. After treated for 48 h， the CYP19 and upstream regulated gene liver receptor homolog-1 （LRH-1） mRNA expression levels were assessed by RT-PCR. Results Compared with the control group， the expression of CYP19 and LRH-1 mRNA increased for 1， 5 and 10 μmol/L Genistein group （P < 0.05）； but the expression of CYP19 and LRH-1 mRNA for 100 μmol/L Genistein group had no significant difference （P > 0.05）. Compared with 10 μmol/L Genistein group， the expression of LRH-1 mRNA decreased for Genistein （10 μmol/L） with Tamoxifen （1 μmol/L） pretreated for 30 min （P < 0.05）， but the expression of CYP19 mRNA was not influenced by Tamoxifen （P > 0.05）. Conclusion 1， 5 and 10 μmol/L Genistein can up-regulation the expression of CYP19 and LRH-1 mRNA in the rats ovarian granulosa cells. The molecular mechanism of Genistein effect on the CYP19 gene expression is not mediated by ER-α.

[Key words] Soy isoflavones； Genistein； Ovarian granulosa cells； CYP19； LRH-1

大豆异黄酮主要活性成分金雀异黄素（Genistein）具有极强的抗氧化能力[1-2]，因化学结构与雌激素非常相似，能与雌激素受体（ER）结合发挥雌激素样作用，也被称为植物雌激素[3]。研究表明，大豆异黄酮可调节雌性内分泌活动，改善围绝经期综合征临床症状[4-8]。卵巢颗粒细胞芳香化酶基因CYP19是雌激素生成的关键酶，之前研究发现，大豆异黄酮可影响衰老模型大鼠卵巢芳香化酶的表达[9]，但分子机制尚不清楚。本研究采用细胞培养、RT-PCR等方法，观察Genistein对大鼠卵巢颗粒细胞CYP19及上游调控基因表达的影响，并利用ER-α阻断剂进一步观察Genistein对CYP19基因表达的影响与ER-α的关系，探讨大豆异黄酮调节卵巢局部内分泌功能的分子机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

25～28日龄未成年健康雌性SD大鼠21只，平均体重（70±10）g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：（黑）2013-002。

1.2 主要仪器及试剂

PTC-100型PCR扩增仪（美国MJ. Research）；UV-752紫外分光光计（英国Amersham）；GIS凝胶图像扫描及分析系统（上海天能生物）。

Genistein（GEN）、17β-雌二醇（17β-E2）及Tamoxifen（TAM）（美国Sigma）；Trizol（美国Invitrogen）；BcaBESTTM RNA PCR Kit（大连Takara）；PCR引物（上海英骏生物合成）。Genistein、17β-E2和Tamoxifen均溶解于70%乙醇，-20℃保存。

1.3 实验分组及处理

实验大鼠7只，颈部皮下注射血清促性腺激素（PMSG，60 U/只），建立促卵泡发育模型。48 h后急性断髓处死大鼠，仔细剥离出双侧卵巢，用小号针头反复刺破卵泡并吹打，使颗粒细胞充分释放，200 μm滤网去除组织残渣后离心，向细胞沉淀中加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液（含青/链霉素），用培养液调整细胞浓度至3×105～5×105个/mL，充分混匀。将细胞悬液分至6孔板（1 mL/孔），37℃培养箱（5%CO2，95%空气）孵育。细胞培养48 h后，加入Genistein（浓度参考文献[10-11]）等因素处理。

细胞共分9组：① 0 μmol/L Genistein组（空白对照组，A组）；②17β-E2（10 nmol/L）组（B组）；③0.1 μmol/L Genistein组（C组）；④1 μmol/L Genistein组（D组）；⑤5 μmol/L Genistein组（E组）；⑥10 μmol/L Genistein组（F组）；⑦100 μmol/L Genistein组（G组）；⑧ER-α阻断剂Tamoxifen（1 μmol/L）预处理30 min后加1 μmol/L Genistein组（H组）；⑨1 μmol/L Tamoxifen预处理30 min后加10 μmol/L Genistein组（I组）。继续培养细胞48 h后，收集细胞于-70℃保存，用于总RNA提取和RT-PCR。各组实验重复3次。

1.4 观察指标及检测方法

采用RT-PCR法检测基因mRNA表达。Trizol提取细胞总RNA，按BcaBESTTM RNA PCR Kit说明书逆转录。采用Gene Runner软件设计引物，以β-actin作为内参。引物序列及产物长度见表1，PCR扩增条件及循环数见表2。产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，GIS凝胶成像系统扫描及条带灰度分析，以目的基因与β-actin灰度比值代表其相对表达量。每组实验重复3次。

1.5 统计学方法

采用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Genistein对颗粒细胞CYP19 mRNA表达的影响

RT-PCR电泳结果显示，各组细胞均扩增出一条清晰的大小约289 bp的CYP19特异片段。见图1。

条带分析结果显示：1、5和10 μmol/L Genistein作用细胞48 h后，D、E、F组CYP19 mRNA表达显著增加，显著高于A组（均P < 0.05）；100 μmol/L Genistein作用后，G组CYP19 mRNA的表达与A组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。Tamoxifen（1 μmol/L）预处理30 min后，分别加入1和10 μmol/L Genistein继续处理48 h，H组CYP19 mRNA表达与D组比较差异无统计学意义（P > 0.05），I组与F组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

与A组比较，*P < 0.05；A～I为A～I组；A组：0 μmol/L Genistein组（空白对照组）；B组：17β-E2（10 nmol/L）组；C组：0.1 μmol/L Genistein組；D组：1 μmol/L Genistein组；E组：5 μmol/L Genistein组；F组：10 μmol/L Genistein组；G组：100 μmol/L Genistein组；H组：ER-α阻断剂Tamoxifen（1 μmol/L）预处理30 min后加1 μmol/L Genistein组；I组：1 μmol/L Tamoxifen预处理30 min后加10 μmol/L Genistein组

2.2 Genistein对颗粒细胞LRH-1mRNA表达的影响

RT-PCR电泳结果显示，各组细胞均扩增出一条清晰的大小约540 bp的LRH-1特异片段。见图3。

M：DNA分子量标准（bp） ；A～I为A～I组；A组：0 μmol/L Genistein组（空白对照组）；B组：17β-E2（10 nmol/L）组；C组：0.1 μmol/L Genistein组；D组：1 μmol/L Genistein组；E组：5 μmol/L Genistein组；F组：10 μmol/L Genistein组；G组：100 μmol/L Genistein组；H组：ER-α阻断剂Tamoxifen（1 μmol/L）预处理30 min后加1 μmol/L Genistein组；I组：1 μmol/L Tamoxifen预处理30 min后加10 μmol/L Genistein组

条带分析结果显示，1、5和10 μmol/L Genistein及10 nmol/L 17β-E2作用颗粒细胞48h后，B、D、E、F组LRH-1 mRNA表达增加，显著高于A组（均P < 0.05）；100 μmol/L Genistein作用后，G组LRH-1 mRNA的表达与A组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。Tamoxifen（1 μmol/L）预处理30 min后，分别加入1和10 μmol/L Genistein继续处理48 h，H组LRH-1 mRNA表达与D组比较差异无统计学意义（P > 0.05），I组则显著低于F组（P < 0.05）。见图4。

3 讨论

研究发现，Genistein可增加卵巢癌细胞对常规化疗药物的敏感性[10]，但其作用机制尚不明确。还有报道Genistein可调节肝细胞HepG2的CYP19表达，诱导细胞系芳香化酶的活性[11]。笔者前期实验发现，大豆异黄酮可上调衰老大鼠卵巢ER-α表达，并促其下游LRH-1和CYP19的表达[9，12]；离体实验也发现，Genistein可调节大鼠卵巢颗粒细胞ER-α mRNA表达[13]。然而，大豆异黄酮对卵巢CYP19表达的影响是否通过ER-α介导，目前仍不明确。因此，本研究以卵巢颗粒细胞CYP19的转录调控为切入点，通过细胞培养，给予不同剂量的Genistein及ER-α阻断剂Tamoxifen等因素处理细胞，应用RT-PCR技术，检测Genistein对CYP19基因表达的影响，探讨其可能的作用机制。RT-PCR结果显示，1、5和10 μmol/L Genistein作用颗粒细胞48 h，可上调CYP19 mRNA的表达；ER-α阻断剂Tamoxifen（1 μmol/L）对Genistein上调CYP19 mRNA的表达无明显抑制作用，提示Genistein对CYP19 mRNA表达的促进作用可能并非通过ER-α途径实现。

孤儿核受体LRH-1作为CYP19上游重要的转录因子，调控卵巢芳香化酶的表达[14-15]。此外，17β-E2能高效诱导乳腺癌细胞LRH-1表达，通过ER-α直接结合于LRH-1启动子[16-17]。LRH-1是否介导ER和CYP19之间的信号传递，从而在卵巢局部发挥对雌激素生成的调节作用目前尚不清楚。本研究结果显示，1、5和10 μmol/L的Genistein及10 nmol/L 17β-E2均可上调卵巢颗粒细胞LRH-1 mRNA的表达，应用ER-α阻断剂Temoxifen预处理细胞后，可明显抑制10 μmol/L Genistein对LRH-1mRNA表达的上调作用，提示ER-α可能介导了Genistein对LRH-1表达的调控。然而，结合CYP19表达及前期ER-α mRNA表达的结果，笔者进一步推测，Genistein虽可调节颗粒细胞ER-α、LRH-1和CYP19的表达，但对CYP19表达的调控可能并非通过ER-α介导。近年有研究发现，子宫内膜异位癌CYP19启动子Ⅰ的表达是通过一种新型膜性ER（G蛋白偶联雌激素受体，GPER）介导的，与经典ER无关，下游经过LRH-1及ERK的信号通路激活CYP19[18-20]。由此推测，Genistein影响卵巢颗粒细胞CYP19的表达也可能是由GPER介导，这还需后续展开更深入的研究证实。

[参考文献]

[1] Chen MN，Lin CC，Liu CF. Efficacy of phytoestrogens for menopausal symptoms：a meta-analysis and systematic review [J]. Climacteric，2015，18（2）：260-269.

[2] 王燕，王艳春，范红艳，等.大豆异黄酮药理作用的研究进展[J].吉林医药学院学报，2013，34（3）：225-228.

[3] Siow RC，Mann GE. Dietary isoflavones and vascular protection： activation of cellular antioxidant defenses by SERMs or hormesis？[J]. Mol Aspects Med，2010，31（6）：468-477.

[4] 李超，刘艾林，杜冠华.天然异黄酮类化合物的药理学研究进展[J].中国新药杂志，2013，22（12）：1415-1420.

[5] 张涛，迟晓星，郭艳萍，等.大豆异黄酮对大鼠卵巢Bcl-2和Bax蛋白表达影响[J].中国公共衛生，2011，27（3）：327-328.

[6] Takagi A，Kano M，Kaga C. Possibility of？breast cancer？prevention：use of soy isoflavones and fermented soy beverage produced using probiotics [J]. Int J Mol Sci，2015， 16（5）：10907-10920.

[7] Varinska L，Gal P，Mojzisova G，et al. Soy and breast cancer： focus on angiogenesis [J]. Int J Mol Sci，2015，16（5）：11728-11749.

[8] Spagnuolo C，Russo GL，Orhan IE，et al. Genistein and cancer：current status，challenges，and future directions [J]. Adv Nutr，2015，6（4）：408-419.

[9] 温海霞，肖晓辉，赵薇，等.大豆异黄酮对衰老大鼠卵巢芳香化酶表达的影响[J].生理学报，2006，58（supple 1）：178.

[10] Solomon LA，Ali S，Banerjee S，et al. Sensitization of ovarian cancer cells to cisplatin by genistein：the role of NF-kappaB [J]. J Ovarian Res，2008，1（1）：9-15.

[11] Ye L，Chan MY，Leung LK. The soy isoflavone genistein induces estrogen synthesis in an extragonadal pathway [J]. Mol Cell Endocrinol，2009，302（1）：73-80.

[12] 张翼鸿，庞海燕，肖晓辉，等.大豆异黄酮及其主要活性成分genistein对大鼠卵巢雌激素受体α表达的影响[J].中华医学杂志，2011，91（28）：1987-1991.

[13] 庞海燕，孟毅，赵薇，等.大豆异黄酮及主要活性成分Genistein对大鼠卵巢LRH-1基因表达的影响[J].国际遗传学杂志，2012，35（3）：151-156.

[14] Fayard E，Auwerx J，Schoonjans K. LRH-1：an orphan nuclear receptor involved in development，metabolism and steroidogenesis [J]. Trends Cell Biol，2004，14（5）：250-260.

[15] Liu DL，Liu WZ，Li QL，et al. Expression and functional analysis of liver receptor homologue 1 as a potential steroidogenic factor in rat ovary [J]. Biol Reprod，2003， 69（2）：508-517.

[16] Clyne CD，Speed CJ，Zhou J，et al. Liver receptor homologue-1（LRH-1）regulates expression of aromatase in preadi？鄄pocytes [J]. J Biol Chem，2002，277（23）：20591-20597.

[17] Annicotte JS，Chavey C，Servant N，et al. The nuclear receptor liver receptor homolog-1 is an estrogen receptor target gene [J]. Oncogene，2005，24（55）：8167-8175.

[18] Lin BC，Suzawa M，Blind RD，et al. Stimulating the GPR30 estrogen receptor with a novel tamoxifen analogue activates SF-1 and promotes endometrial cell proliferation [J]. Cancer Res，2009，69（13）：5415-5423.

[19] Smith HO，Arias-Pulido H，Kuo DY，et al. GPR30 predicts poor survival for ovarian cancer [J]. Gynecol Oncol，2009， 114（3）：465-471.

[20] Skrzypczak M，Schuler S，Lattrich C. G protein-coupled estrogen receptor（GPER）expression in endometrial adenocarcinoma and effect of agonist G-1 on growth of endometrial adenocarcinoma cell lines [J]. Steroids，2013， 78（11）：1087-1091.

（收稿日期：2016-09-02 本文編辑：程 铭）